[发明专利]PirB基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法

权利要求书

1.PirB基因敲入的小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠动物模型包括确定PirB基因的待敲入的特异性靶位点gRNA1和gRNA2，将PirB基因敲入C57BL/6J小鼠的ROSA26基因的内含子1内，所述gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；按照以下步骤进行实施：

步骤1、基于CRISPR/Cas9技术构建针对C57BL/6J小鼠ROSA26基因内含子1的特异性gRNA1和gRNA2，所述gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述gRNA2的基因序列如SEQ IDNO.2所示；

得到gRNA1和gRNA2后需要将gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成二级结构；

步骤2、构建“CAG promoter-loxP-Stop-loxP-Kozak-mouse PirbCDS-polyA”基因盒打靶载体，将打靶载体进行线性化处理；

步骤3、步骤2中将含有loxP位点打靶载体、步骤1中有活性的gRNA1和gRNA2和Cas9蛋白共同注射进入代孕小鼠受精卵中，获得 F0代小鼠；

gRNA1、gRNA2的浓度均为2~10pmol/ul，Cas9蛋白的注射浓度为30~100ng/μL；

步骤4、将步骤3中性成熟的阳性F0小鼠分别与野生型鼠交配繁一代，获得F1代杂合子小鼠，通过PCR、测序和Southern杂交鉴定动物基因型；

中Southern杂交采用BamHI和AvrII核酸内切酶切割F1代杂合子小鼠的DNA；

步骤5、将步骤4获得的F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为PirB基因敲入的小鼠动物模型。