[发明专利]PirB基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法

说明书

本发明公开了PirB基因敲入的小鼠动物模型，该模型包括确定PirB基因待敲入的特异性靶位点的gRNA1和gRNA2，将PirB基因敲入C57BL/6J小鼠的ROSA26基因的内含子1内，gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还具体公开了上述小鼠动物模型的构建方法，本发明的小鼠动物模型对于PirB基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础。通过PirB敲入动物模型与不同类型Cre小鼠的杂交，可以用于研究PirB在不同器官或不同细胞类型或不同疾病模型的功能。

技术领域：

本发明属于遗传学和生物技术领域，具体涉及PirB基因敲入的小鼠动物模型，还涉及上述小鼠动物模型的构建方法。

背景技术

鼠源成对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B，PirB)，是人类免疫球蛋白样受体B2(human leukocyte immunoglobulin(Ig)-likereceptor B2，LILRB2)的同源基因，PirB基因(NCBI reference sequence：NM_011095.2)位于小鼠的7号染色体近端，总大小为8.97kb，编码841个氨基酸，目前鉴定出15个外显子，外显子1起始密码为ATG，外显子15的终止密码子是TGA(转录本：Pirb-201ENSMUST00000078451.6)。PirB蛋白属于I型跨膜糖蛋白，包含由六个免疫球蛋白样结构域(domain，D)组成(D1-D6)的胞外段，一个疏水的跨膜段，三个免疫受体酪氨酸依赖的抑制序列(immunoreceptortyrosinebased inhibitory motifs，ITIMs)和一个ITIMs样序列组成的胞内段。理论上讲，PirB的分子量约为92kD，但是Western-blot分析中，PirB经常位于105kD处，因为PirB是糖蛋白。以往研究发现，PirB在免疫系统和中枢调节中均发挥重要作用。

在免疫系统中，PirB在许多造血细胞都有表达，包括B细胞、肥大细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突细胞，但是在胸腺细胞、成熟的T细胞和自然杀伤细胞不表达，另外PirB在髓细胞和B细胞的表达随细胞分化和激活增加。在免疫系统，PirB作为主要组织相容性复合物1(class I major histocompatibility complex，MHC1)的受体，广泛参与免疫调节，包括中性粒细胞和巨噬细胞整合素通路、细胞毒性T淋巴细胞激活、B淋巴细胞激活和体液—细胞免疫应答等。PirB的前两个细胞外免疫球蛋白结构域(D1-D2)介导MHCI和PirB的结合。

在中枢神经系统(central nervous system，CNS)，PirB在许多脑区包括皮层、海马、小脑和嗅球都有表达，但在成年脊髓不表达。在细胞层面，PirB不仅表达于神经元，也表达于星形胶质细胞。在许多病理条件下，如脑外伤、中风和CNS感染，PirB的mRNA和蛋白表达水平显著增加。在CNS，PirB是髓鞘抑制因子Nogo-A、MAG、OMgp的受体，参与神经元突起芽发和生长锥塌陷，抑制神经元轴突再生和突触可塑性。PirB的细胞外免疫球蛋白结构域(D3-D6)介导了PirB与NogoA的结合。近年来关于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)研究还发现，PirB是Aβ42寡聚体的高亲和力受体，亲和力达到纳摩尔水平。PirB的前两个细胞外免疫球蛋白结构域(D1-D2)介导了Aβ42寡聚体和PirB的相互作用，导致丝切蛋白(cofilin)信号通路增强。免疫组织化学染色结果发现，PirB在轴突生长锥表达，位于富含肌动蛋白的前缘和synapsin免疫阳性的囊泡中，在神经元突起的表达呈点状分布。文献表明，PirB表达随年龄增加，特别是在老龄认知损伤的小鼠海马中，PirB能够抑制轴突再生和突触可塑性。研究表明小鼠Aβ寡聚体对海马长时程增强的破坏作用需要PirB的参与，在AD转基因模型中，PirB不仅参与成年小鼠记忆缺失，而且介导幼年小鼠视皮层突触可塑性的丢失。这些研究提示我们，PirB参与突触可塑性，抑制PirB可能对AD起到治疗效应。但是在CNS，PirB的功能和下游抑制性信号通路仍然未被阐明，因此迫切需要PirB的细胞和动物模型。