[发明专利]基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法

权利要求书

1.基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法，其特征在于，包括以下过程：

S1，利用大蒜种质资源培育大蒜种苗，待种苗长出4片叶时，采取幼嫩叶片置于自封袋中，使用冷冻抽干机抽干后封口置于4℃冷藏；

S2，使用改良的CTAB法提取大蒜叶片中的基因组DNA，并用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量；

提取基因组DNA的过程如下：

S21，称取100mg大蒜叶片干粉置于2.0mL离心管中，在离心管中加入700μL 65℃含1β-巯基乙醇的2CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；

S22，在离心管中加入700μL的氯仿抽提液，上下翻转混匀、抽提5min，抽提液由氯仿和异戊醇按照体积比24：1配制而成，将离心管置于转速为12000rpm的离心机中离心10min；

S23，吸取400μL离心上清液置于另一个2.0mL的离心管中，在上清液中加入400μL氯仿抽提液，上下翻转混匀、抽提5min，将离心管置于转速为12000rpm的离心机中离心10min；

S24，吸取400μL离心上清液置于1.5mL离心管中，加入两倍体积的异丙醇在-20℃预冷，轻轻翻转5次，于-20℃沉淀至DNA抱团析出；

S25，弃去上清液，用70％乙醇清洗沉淀1～2次，将沉淀置于50℃烘箱中烘干；

S26，向1.5mL离心管中加入100μL含1％RNase的ddH₂O溶解DNA，37℃水浴1h；

S27，用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和1μL琼脂糖凝胶检测DNA的浓度和质量，将合格的DNA样本置于-20℃冰箱保存备用；

S3，合成SSR引物，根据PCR扩增对SSR引物的结构要求对SSR引物进行初级筛选，使用8％聚丙烯凝胶电泳对SSR引物进行复筛，筛选出具有多态性的24对引物；

筛选的24对SSR引物均包括正向引物和反向引物，各SSR引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1至SEQ ID No.48所示；

按照以下结构标准对SSR引物进行初筛：(1)重复单元不少于3bp；(2)重复单元的重复数不超过10个；(3)重复单元不完全由AT或GC组成；(4)目标SSR位点周围不存在其他的SSR位点；

S4，使用筛选的SSR引物对大蒜叶片的基因组DNA进行PCR扩增，质控后将用相同基因组模块获得的扩增产物混合得到SSR位点的DNA富集片段，其中每个SSR位点扩增产物的量相同；

PCR扩增体系如下：2μL质量浓度为50ng/μL的DNA模板、2μL的10×Buffer、0.5μL摩尔浓度为2.5mmol/L的dNTPs、0.75μL摩尔浓度为10μmol/L的正向引物、0.75μL摩尔浓度为10μmol/L的反向引物、0.5μL 2.5U/μL的Taq酶和14.5μL的超纯水；

PCR扩增过程如下：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性 30s，55℃退火30s，94℃预变性1min，72℃延伸5min，循环30个周期；(3)72℃延伸5min后置于4℃冷藏保存；

S5，在DNA富集片段上添加特异性标签序列，定量后使用Ilumina Hiseq/Miseq平台，以2×150/2×250bp的双端模式上机测序；

S6，将测序结果输入Popgene32计算得到等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon’s信息指数I、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Nei’s基因多样性指数H，使用R包polysat进行遗传距离计算和主成分分析，分别使用R包phangorn中的UPGMA方法和ggtree进行进化树的构建和绘制，利用Structure V2.3.4软件分析大蒜种质资源的群体遗传结构，根据主成分分析、进化树或遗传结构对大蒜种质资源进行分类。