[发明专利]基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法

说明书

本发明公开了一种基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法，具体包括以下过程：S1，利用大蒜种质资源培育大蒜种苗，采集幼嫩叶片置于自封袋中，抽干后封口置于4℃冷藏；S2，使用CTAB法提取大蒜叶片的基因组DNA，检测DNA的质量；S3，合成SSR引物，从合成的引物中筛选出具有多态性的引物；S4，使用筛选的引物对大蒜叶片的DNA进行PCR扩增，获得SSR位点的DNA富集片段；S5，在DNA富集片段上添加特异性标签序列，对其进行测序；S6，根据检测结果对大蒜种质资源进行分类；本发明基于SSRseq分子标记对大蒜种质资源进行分类，分类结果准确、可靠性高，且分类过程简单、易操作。

技术领域

本发明属于遗传学技术领域，特别是涉及一种基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法。

背景技术

国家无性繁殖及多年生蔬菜种质资源圃保存了来自34个国家和地区的大蒜资源，Wang在2016年利用SSR引物，结合AFLP和InDel标记对资源圃中212份大蒜资源进行了遗传多样性分析，鉴于目前表型和基因型鉴定是种质资源高效利用的前提，分子标记相对于表型评价，具有稳定性强、重复性好、操作简单、不受时空限制等优势，能够快速、准确的对种质资源的遗传多样性进行分析，基于此Wang的研究结果为了解资源圃保存种质的遗传多样性提供了一定的分子基础，但由于其使用的引物数量较少，对大蒜种质资源的分类考虑不够全面，分类结果不准确，对资源圃保存资源的亲缘关系和遗传背景分析尚不够全面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法，基于基因型对大蒜种质资源进行分类，不受外界环境的干扰，分类结果更加准确，且本发明筛选出24对SSR引物用于大蒜种质资源分类，考虑的基因组更为全面，分类也更加细致、准确。

本发明所采用的技术方案是，基于SSRseq分子标记的大蒜种质资源分类方法，包括以下过程：

S1，利用大蒜种质资源培育大蒜种苗，待种苗长出4片叶时，采取幼嫩叶片置于自封袋中，使用冷冻抽干机抽干后封口置于4℃冷藏；

S2，使用改良的CTAB法提取大蒜叶片中的基因组DNA，并用Bio Spec-nano核酸微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量；

S3，合成SSR引物，根据PCR扩增对SSR引物的结构要求对SSR引物进行初级筛选，使用8％聚丙烯凝胶电泳对SSR引物进行复筛，筛选出具有多态性的24对引物；

按照以下结构标准对SSR引物进行初筛：(1)重复单元不少于3bp；(2)重复单元的重复数不超过10个；(3)重复单元不完全由AT或GC组成；(4)目标SSR位点周围不存在其他的SSR位点；

S4，使用筛选的SSR引物对大蒜叶片的基因组DNA进行PCR扩增，质控后将用相同基因组模块获得的扩增产物混合得到SSR位点的DNA富集片段，其中每个SSR位点扩增产物的量相同；

S5，在DNA富集片段上添加特异性标签序列，定量后使用Ilumina Hiseq/Miseq平台，以2×150/2×250bp的双端模式上机测序；

S6，将测序结果输入Popgene32计算得到等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon’s信息指数I、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Nei’s基因多样性指数H，使用R包polysat进行遗传距离计算和主成分分析，分别使用R包phangorn中的UPGMA方法和ggtree进行进化树的构建和绘制，利用Structure V2.3.4软件分析大蒜种质资源的群体遗传结构，根据主成分分析、进化树或遗传结构对大蒜种质资源进行分类。

进一步的，所述S2中提取基因组DNA的过程如下：

S21，称取100mg大蒜叶片干粉置于2.0mL离心管中，在离心管中加入700μL 65℃含1β-巯基乙醇的2CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；