[发明专利]敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用

权利要求书

1.敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用，所述的解淀粉芽胞杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2015234，所述的nanR基因为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因，其方法包括：

（1）以保藏编号为CCTCC NO：M2015234的解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂；

（2）通过重叠延伸PCR将nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；

（3）采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（4）准备质粒 T2(2)-ori，并采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔnanR；

（6）将敲除质粒T2(2)-ΔnanR转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

（7）将阳性转化子在转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到nanR基因的上游同源臂或nanR基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（8）挑选nanR基因的上游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与nanR基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了nanR基因的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）LX-12ΔnanR。

3.根据权利要求1所述的应用，在应用过程中以敲除了解淀粉芽胞杆菌nanR基因的菌株发酵生产1-脱氧野尻霉素时，其发酵培养基配方为：

60-100 g/L豆粕；50-80g/L玉米淀粉；0.5-1.0 g/L KH₂PO₄；0.3-0.6g/L MgSO₄·7H₂O；0.1-0.3 g/LFeSO₄·7H₂O；0.01-0.05 g/L MnSO₄·H₂O，其余为水。