[发明专利]敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1‑脱氧野尻霉素产量中的应用，本发明通过基因工程的方法敲除了解淀粉芽胞杆菌LX‑12的基因组内的nanR基因，成功得到了缺失nanR基因的解淀粉芽胞杆菌LX‑12ΔnanR。相对于解淀粉芽胞杆菌LX‑12，本发明所构建得到的工程菌株LX‑12ΔnanR发酵后1‑脱氧野尻霉素产量至少提高了15%，为提高1‑脱氧野尻霉素产量提供了一种新的方法。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用，通过敲除解淀粉芽胞杆菌转录调控因子nanR，提高了解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素产量，这为解淀粉芽胞杆菌高产1-脱氧野尻霉素提供了一种策略。

背景技术

糖尿病已经成为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁人类的第三号杀手，对全球的健康和经济带来了重大的威胁。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)简称DNJ或1-DNJ，是一种多羟基哌啶类生物碱，具有强效的α-葡萄糖苷酶抑制活性。1-脱氧野尻霉素及其衍生物作为高效的糖苷酶抑制剂，在药物开发中受到广泛重视。近年来利用微生物合成1-脱氧野尻霉素已成为研究热点，但目前微生物合成1-脱氧野尻霉素的产量低，还不能满足市场的需求。

NanR是一种转录调控因子，其在解淀粉芽胞杆菌中的调控网络和调控具体的基因还没有相关报道。本专利通过敲除解淀粉芽胞杆菌LX-12中转录调控因子NanR，提高了解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素的产量。本发明首次通过敲除转录因子基因nanR来提高1-脱氧野尻霉素产量，为1-脱氧野尻霉素高产提供一种新方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用。

本发明的另一个目的在于提供了敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因的方法。

本发明的最后一个目的在于提供了敲除了nanR基因的解淀粉芽胞杆菌在高产1-脱氧野尻霉素产量中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用，包括利用本发明的常规技术，将解淀粉芽胞杆菌中的nanR基因敲除，敲除后的菌株可用于1-脱氧野尻霉素的发酵生产；

以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌为生产1-脱氧野尻霉素的菌株；

以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2015234。

以上所述的应用中，解淀粉芽胞杆菌基因nanR的敲除方法，包括以下步骤：

(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12(CCTCC NO：M2015234)的基因组DNA为模板，PCR扩增出nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂；

(2)通过重叠延伸PCR将nanR基因的上游同源臂和nanR基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；

(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

(4)准备质粒T2(2)-ori，并采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔnanR；

(6)将敲除质粒T2(2)-ΔnanR转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；