[发明专利]一种含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂，它是以CCL19的重组表达基因为活性成分，加上叶酸修饰的聚合物形成的纳米制剂。本发明还公开了前述纳米制剂的制备方法和用途。本发明含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂可以高效地将CCL19重组表达基因转入细胞，提高CCL19表达效率，治疗结肠癌的效果优良，临床应用前景良好。

技术领域

本发明涉及一种含有CCL19重组表达基因的纳米制剂及其制备方法和用途。

背景技术

CCL19(Chemokine C-C motif ligand 19)属于CC类趋化因子，又称EB病毒诱导分子或人巨噬细胞炎性蛋白3β，主要在次级淋巴组织和器官如脾和淋巴结的T细胞中表达，趋化幼稚T细胞和成熟DC细胞。CCL19在抗肿瘤中起着关键作用，主要通过以下途径：诱导树突状细胞进入肿瘤组织；介导T细胞参与杀伤肿瘤细胞；肿瘤组织中表达的CCL19诱导免疫细胞浸润肿瘤，释放其他细胞因子；直接与CCR7受体结合，激活受体后通路抑制肿瘤增殖、侵袭及转移。CCL19招募免疫细胞到肿瘤部位，诱导抗原提呈和效应细胞活化，增强肿瘤局部多种免疫因子，克服肿瘤微环境的免疫抑制，在肿瘤的免疫治疗中趋化抗原提呈细胞等方面发挥重要作用。研究表明,CCL19能够明显抑制肿瘤的生长和转移,以及延长荷瘤动物的生存时间。

但是，低转染效率极大的限制了CCL19在抗癌药物中的应用。为了提高基因的转染效率，能够将基因运载进入体内的载体引起了广泛的研究。目前使用的基因载体主要包括两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关载体，可高效地将治疗基因传递到细胞内，但其规模生产难度大，可递送的基因容量小，易引起免疫反应，有潜在的生物安全风险。非病毒基因载体包括脂质体、阳离子纳米粒、无机纳米粒子载体等，具有免疫原性低，安全性较好，易大规模生产等特点，是当前基因导入系统研究的热点。

但是，目前还未见报道能够将CCL19高效转染进入细胞的基因载体，含有CCL19基因的高效抗肿瘤药物也还未见报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种含有CCL19重组表达基因的叶酸修饰的纳米制剂，它是以CCL19的重组表达基因为活性成分，加上聚合物形成的纳米制剂。

进一步地，所述CCL19重组表达基因的核苷酸酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的聚合物是以DOTAP，MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA作为原料制得的聚合物。

进一步地，所述DOTAP和MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA的质量比为：2:14:3～4:14:3，优选3:14:3；

和/或，所述MPEG-PLA的分子量为5000，且其中MPEG嵌段的分子量为2000，PLA嵌段的分子量为3000；所述Fa-MPEG-PLA是上述MPEG-PLA接上等摩尔的叶酸后得到的。

进一步地，所述CCL19重组表达基因与聚合物的质量比为1:(25～150)；优选为1：(25～100)。

本发明还提供了一种制备上述含有CCL19重组表达基因的纳米制剂的方法，步骤如下：

a、称取原料，溶于有机溶剂；所述原料是DOTAP，MPEG-PLA和Fa-MPEG-PLA；

b、减压除去有机溶剂，再在室温高真空条件保温；

c、水化脱膜，过滤，得聚合物；

d、将CCL19的重组表达基因与聚合物混合，孵育既得。

进一步地，步骤a所述原料与有机溶剂的质量体积比为(95～105):4mg/ml；所述有机溶剂为丙酮；和/或，步骤b所述减压除去有机溶剂的温度为55℃，时间为1h；所述保温时间为6h以上。