[发明专利]一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法

权利要求书

1.一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

第一步、设计扩增AaIT基因引物，引物设计时分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，利用设计的引物从pUC57-AaIT中扩增AaIT基因序列；

第二步、AaIT基因的PCR扩增产物经纯化后，用BamHI和EcoRI酶进行酶切，同时用BamHI和EcoRI酶酶切pbarGPEl；分别进行纯化后，建立连接反应体系连接AaIT基因和pbarGPEl；

第三步、连接产物转化大肠杆菌感受态细胞并进行验证，构建成pbarGPEl-AaIT载体；

第四步、设计含Not1酶切位点的引物，从pbarGPEl-AaIT载体扩增出GpdA-AaIT-TrpC表达盒；

第五步、用Not1酶酶切pGPS3Ben-bbchit1，并进行去磷酸化处理；

第六步、将第五步得到的去磷酸化处理的pGPS3Ben-bbchit1和GpdA-AaIT-TrpC表达盒连接，获得pGPS3Ben-bbchit1-AaIT表达载体，转化大肠杆菌，提取质粒；

第七步、第六步提取的质粒采用冻融法导入根癌农杆菌感受态细胞中，进行抗性筛选，获取根癌农杆菌阳性菌落；

第八步、球孢白僵菌孢子悬液和含pGPS3Ben-bbchit1-AaIT载体的根癌农杆菌菌液混合，经在固体IM培养基上共培养和CPZ选择培养基上多次筛选获得转化工程菌株。

2.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于：所述第一步中扩增AaIT基因引物分别引入BamHI和EcoR1酶切位点，引物序列为：AaIT-F-BamHI如5'-SEQ ID NO：1-3'所示；AaIT-R-EcoRI如5'-SEQ ID NO：2-3'所示。

3.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于：所述第二步中所用pbarGPEl载体含有BamHI和EcoRI酶切位点。

4.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于，所述第二步中连接反应体系中AaIT和pbarGPEl的浓度摩尔比为3:1。

5.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于：所述第三步中所用大肠杆菌感受态为DH-5α。

6.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于：所述第四步中从pbarGPEl-AaIT载体扩增GpdA-AaIT-TrpC所用的正反引物序列均含Not1酶切位点。

7.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于：所述第七步中悬菌体是涂布在含氨苄和苯菌灵的YEB平板上，其中氨苄和苯菌灵浓度分别为12.0μg/m和8.0μg/mL。

8.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于：所述第八步中固体IM培养基上含：NaCl以w/v记为0.03％，MgS0₄.7H₂以w/v记为00.03％，K₂HP0₄以w/v记为0.03％，甘油以v/v记为0.5％，MES 0.04mmo1/L，还包括3.5mmol/L葡萄糖和350mmol/L乙酰丁香酮。