[发明专利]一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法

说明书

本发明公开了一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，设计引物从pUC57‑AaIT载体中PCR扩增AaIT基因，经酶切、纯化和pbarGPEl构建pbarGPEl‑AaIT载体；用引物扩增出GpdA‑AaIT‑TrpC表达盒；用Not1单酶切pGPS3Ben‑bbchit1并去磷酸化，与用Not1酶切的GpdA‑AaIT‑TrpC连接，转化筛选获得pGPS3Ben‑bbchit1‑AaIT表达载体，将其导入根癌农杆菌感受态细胞中获得阳性转化子菌落；球孢白僵菌孢子悬液和含pGPS3Ben‑bbchit1‑AaIT载体的根癌农杆菌液混合，经固体IM培养基、CPZ选择培养基筛选获得转化球孢白僵菌工程菌株。本发明构建的球孢白僵菌工程菌株可制备高效杀虫生物防治剂，对环境无污染且防治效果良好，适合在生物防治技术领域推广。

技术领域

本发明涉微生物虫害防治技术领域，尤其涉及一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法。

背景技术

真菌杀虫剂是以昆虫病原真菌为有效成分的生物农药，目前世界上已记载的杀虫真菌大约有100个属，800多个种，其中约50％集中于半知菌亚门(Deuteromycotina)，主要分布在白僵菌属((Beau veria)、绿僵菌属(Metarhizium)、拟青霉属(Paecilomyces)、被毛孢属(Hirsutella)、蟪霉属(Nom uraea)、轮枝霉属(Verticillium)等。在中国、巴西、俄罗斯和欧美国家，真菌杀虫剂已广泛用于农林害虫和城市昆虫的防治。目前世界上已有60多个真菌杀虫剂产品问世。同时与其它杀虫微生物相比，昆虫病原真菌具有主动致病昆虫、扩散效果好、土壤宿存能力较长、寄主不易产生抗性和容易生产等优点。因此，昆虫病原真菌在害虫防治已得到广泛的开发和应用。

昆虫病原真菌中，研究最多、应用效果最好的是白僵菌(Beauveria bassiana)。白僵菌的分布范围很广，从海拔几米至2000多米的高山均有白僵菌的存在，白僵菌可以侵入6个目15科200多种昆虫、螨类。与细菌、病毒等需要被昆虫取食到消化道后才能发挥毒杀作用机理不同，白僵菌经分生孢子对寄主的附着、萌发、直接穿透表皮，菌丝在血腔内生长，产生白僵素(大环脂类毒素)和草酸钙结晶，引起昆虫中毒，导致昆虫死亡。白僵菌主要通过昆虫体壁侵入虫体内。对咀嚼式和刺吸式口器的害虫都有效果。它与环境具有很好的相容性，对人畜安全，对有益昆虫无毒害，并且还能够在环境中存活、扩散、定殖，保持一定的种群数量，从而能够持续使害虫数量处于低水平状态，实现植物保护和环境保护的可调持续发展。因此，白僵菌在害虫综合治理方面受到了越来越多的关注，成为生物农药研究和发展的理想选择之一。

球孢白僵菌已开发成为广泛应用的微生物杀虫剂。1995年美国环保暑(EPA)允许Mycotech公司生产的球孢白僵菌制剂Mycotrol RWP用于防治蚜虫和粉虱。我国20世纪50年代开始白僵菌的研究和应用，2006年球孢白僵菌在我国获得登记。多年来，国内应用白僵菌对近40种农林害虫进行了有效防治，主要包括松毛虫、玉米螟、茶小绿叶蝉、蛴螬、蝗虫、桃小食心虫、黄地老虎、地老虎、马铃薯甲虫、松褐天牛、白蚁、水稻叶蝉、木麻黄毒蛾、樟荣叶甲、甘薯象甲、茶小绿叶蝉、大豆食心虫、三化螟、糜子地老虎、黑翅白蚁、甜菜象甲、三叶草夜蛾、白杨透翅蛾等。应用球孢白僵菌防治松毛虫、玉米螟是世界上杀虫真菌应用面积最大、最为成功的事例之一，目前仍保持50万hm²/年，应用面积最高年份达134万hm²，其中，球孢白僵菌对松毛虫的防治效果可达90％以上。

但是，球孢白僵菌也和其他生物农药一样也具有较长的侵染潜伏期，击倒害虫速度慢、防效不稳定、杀虫谱过窄等缺点，这一直是影响其应用推广的重要因素，也导致真菌杀虫剂在农药市场的占有率低。