[发明专利]一种表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及制备方法、应用

权利要求书

1.一种慢病毒表达载体，其特征在于：包含有编码嵌合抗原受体的基因和IL-6R阻断剂托珠单抗（Tocilizumab），所述编码嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述IL-6R阻断剂托珠单抗（Tocilizumab），其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于：所述慢病毒表达载体的结构为pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab，其表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根据权利要求1或2所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述种IL-6R阻断剂，托珠单抗，依次包含KOZAK、信号肽、轻链可变区、铰链区、重链可变区、IgG1-Fc。

4.一种含有如权利要求1-3任一项所述的慢病毒表达载体的试剂盒，包括权利要求1或2所述的慢病毒表达载体。

5. 一种利用如权利要求1-3任一项所述的慢病毒表达载体制备表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将CD8穿膜信号肽、anti-CD19 Scfv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3 Zeta TCR激活区、IRES、Tocilizumab依序克隆到慢病毒骨架质粒pHR中，得到pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab质粒；

（2）将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT 细胞中，转染后6h ～ 8h 更换为完全培养基培养，48h 后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm 滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液；

（3）取50mL新鲜血液，通过淋巴细胞分离液进行密度梯度离心来分离单个核细胞，将单个核细胞重悬至CTS^TM AIM V^TM SFM培养基中，同时添加CD3单抗和CD28单抗来激活T淋巴细胞，37℃ 5%CO2培养48小时；

（4）取2×10⁶的细胞，按照MOI=5加入浓缩的重组慢病毒的溶液， 同时加入IL-2和polybrene，混匀，37℃ 5%CO2培养6-8小时，300g 5min离心换液为新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基；每2-3天加入新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基，维持细胞密度在1×10⁶/mL，扩增10-12天，得表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞-pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述CTS^TM AIM V^TM SFM培养基还含有5%的ICS。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述CTS^TM AIM V^TM SFM培养基中还含有200IU/ml IL-2。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的慢病毒表达载体在制备预防、治疗或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述恶性肿瘤选自B细胞急性淋巴细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤。