[发明专利]用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组及筛选方法

权利要求书

1.用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组，其包括以下引物对中的任意一项或多项组合：

引物对A，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为CATCATGGTTTGACTGACGG，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示为TCAGAAACTGTATTCCCGCC；

引物对B，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示为CACTTCGGATTCATTCATGG，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示为GACGACTGGCTGATACGGTT；

引物对C，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示为GACACTTCACCCTCCTCAGC，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示为GGTGGAAATGGAAAGCGTTA；

引物对D，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示为CCACACTAAGCCCAACCCTA，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示为CAGATCACTGCTATCGGCAA。

2.一种用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物对A、引物对B、引物对C和引物对D中的任意一项或多项组合。

3.如权利要求1所述的用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)获取目标杂交莲瓣兰样本的原始基因数据库；

(2)对步骤(1)中所述原始基因数据库进行SSR位点搜索，其中一、二、三、四、五、六核苷酸的重复数目分别至少为10、6、5、5、5、5次；

(3)将步骤(2)中搜索得到的SSR位点的上下游序列作为目标序列，使用Primer5.0对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；

(4)分别选择8个不同品种的兰花样本，并且按照常规方法提取DNA作为模版，使用所述候选引物进行PCR扩增，扩增后的产物通过毛细管电泳、分型，在使用GeneMarker软件进行条带分析，初步筛选出能扩增出步骤(3)中的目标序列的初筛分PCR引物；然后提取与所述目标杂交莲瓣兰不同的杂交莲瓣兰的DNA为模版，使用初筛分PCR引物进行PCR扩增，扩增后的产物通过毛细管电泳、分型，在使用GeneMarker软件进行条带分析，筛选出能扩增出步骤(3)中的目标序列的引物，即可得到用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组。

4.根据权利要求3所述的用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组的筛选方法，其特征在于：步骤(1)是按照常规方法对目标杂交莲瓣兰样本的RNA进行转录组测序获得EST标签序列，然后使用MISA软件获得所有重复序列所在序列区段，建立重复序列数据库作为目标杂交莲瓣兰样本的原始基因数据库。

5.根据权利要求3所述的用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组的筛选方法，其特征在于：步骤(1)中所述目标杂交莲瓣兰样本为目标杂交莲瓣兰的生根组培苗，或者是目标杂交莲瓣兰的一年生植株或两年生植株的叶片；步骤(4)中所述的兰花样本为兰花的生根组培苗，或者是兰花的一年生植株或两年生植株的叶片。

6.根据权利要求3所述的用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组的筛选方法，其特征在于：步骤(4)中是提取45种以上与所述目标杂交莲瓣兰不同的杂交莲瓣兰，分别用初筛分PCR引物进行PCR扩增；所述与所述目标杂交莲瓣兰不同的杂交莲瓣兰是莲瓣兰与以下品种杂交得到的杂交莲瓣兰：墨兰、蕙兰、春兰、建兰、春剑、寒兰。

7.根据权利要求3所述的用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组的筛选方法，其特征在于：步骤(3)中所述候选引物的设计参数为：引物长度为20bp，GC含量为35％～60％，退火温度为60℃，PCR扩增产物预期片段长度为110bp～300bp。

8.根据权利要求3所述的用于杂交莲瓣兰EST-SSR标记的引物组的筛选方法，其特征在于：步骤(4)中所述PCR扩增为两步法PCR扩增，所述两步法PCR扩增包括以下步骤：

第一步PCR扩增，其反应体系的总体积为10μL，并且由以下体积的组分组成：1μL的浓度为20ng/μL的模版，0.1μL的浓度为10μmol/L的上游引物，0.1μL的浓度为10μmol/L的下游引物，5μL的2xTaq PCR MasterMix，余量为ddH₂O；所述第一步PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，其次于95℃变性30s，60℃的退火温度退火30s，72℃延伸30s，共20个循环，然后72℃延伸10min得到第一步扩增产物；

第二步PCR扩增，其反应体系的总体积为20μL，并且由以下体积的组分组成：2μL的第一步扩增产物，0.15μL的浓度为10μmol/L的第一步PCR扩增使用的下游引物，0.15μL的浓度为10μmol/L的M13引物，10μL的2xTaq PCR MasterMix，余量为ddH₂O；所述第二步PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，其次于95℃变性30s，52℃的退火温度退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，然后72℃延伸10min；所述M13引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示为TGTAAAACGACGGCCAGT。