[发明专利]一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法

权利要求书

1.一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，包括：

破碎步骤：利用60-100W超声波将收集得到的融合度达到85%的人源脐带充质干细胞进行超声破碎10-30min，得到破碎细胞液；所述超声破碎的超声交替地作用1-5s、停止2-6s；所述人源脐带充质干细胞为经过0.9%氯化钠注射液重悬后浓度为5×10⁶-1×10⁷个/ml的P5代人源脐带间充质干细胞；

离心步骤：所述破碎细胞液在温度为2-8℃、离心力为2000-5000g的条件下离心10-30min，离心后取上清液；

纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/5-1/10的浓缩液；利用截留分子量为100KD的中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。

2.如权利要求1所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，在所述破碎步骤前，还包括传代细胞培养步骤：

A1：将细胞浓度为3×10⁴-5×10⁴个/ml的Pi代人源脐带间充质干细胞悬液接种到培养瓶中，置于温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中培养，直至细胞融合度达到80%-90%时，弃去上清的液体；

A2：往培养瓶中加入胰酶消化液进行消化；待贴壁的细胞完全掉下来后，加入无血清间充质干细胞完全培养液终止消化，得到细胞悬浮液；

A3：所述细胞悬浮液在400g条件下离心5min，得到第一沉淀物；

A4：用0.9%氯化钠注射液清洗所述第一沉淀物，然后用无血清间充质干细胞完全培养液重悬所述第一沉淀物得到P（i+1）代人源脐带间充质干细胞悬液；

A5：重复步骤A1至A4直至得到P5代人源脐带间充质干细胞悬液;

其中，i=1,2,3,4。

3.如权利要求2所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，在所述传代细胞培养步骤前，还包括脐带组织原代培养步骤：

B1：按照1ml无血清间充质干细胞完全培养液种植0.15-0.4g脐带组织小块的比例，将脐带组织小块种植于装载有无血清间充质干细胞完全培养液的培养瓶中，放入温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，静置1-2h；

B2：向培养瓶中加入无血清间充质干细胞完全培养液培养7天；

B3：将培养瓶中的无血清间充质干细胞完全培养液全部倒掉，并更换全新的无血清间充质干细胞完全培养液，静置培养5天；

B4：将培养瓶中的无血清间充质干细胞完全培养液倒掉一半，并更换一半全新的无血清间充质干细胞完全培养液，静置培养3天；

B5：镜下观察细胞状态，当细胞融合度达到50-60%时，除去无血清间充质干细胞完全培养液；

B6：往培养瓶中加入胰酶消化液，然后置于温度为37℃、 CO₂浓度为5%的培养箱中静置2-3min；

B7：往培养瓶中加入无血清间充质干细胞完全培养液终止消化，然后在400g条件下离心5min，得到第二沉淀物；

B8：往所述第二沉淀物中加入无血清间充质干细胞完全培养液重悬，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。

4.如权利要求3所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，在所述脐带组织原代培养步骤前，还包括脐带组织前处理步骤：

C1：无菌条件下，取两端结扎的新鲜脐带，消毒后，置于含有抗生素的0.9%氯化钠注射液中；

C2：用手术剪剪去脐带结扎处的两端并弃去，将剩下中间段的脐带剪成2～4cm/节，得到脐带组织段；

C3：加入0.9%氯化钠注射液洗涤所述脐带组织段的血凝块，重复洗涤3-5次，剖开所述脐带组织段，剥离脐带外膜，并将脐动脉和静脉去除，获得华通氏胶组织；

C4：采用0.9%氯化钠注射液对所述华通氏胶组织反复漂洗3次以上，然后对所述华通氏胶体组织进行剪切，得到体积为1～2mm³的所述脐带组织小块。