[发明专利]一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法

说明书

本发明提供一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，包括以下步骤：破碎步骤：利用60‑100W超声波将收集得到的融合度达到80‑90％的人源脐带充质干细胞进行超声破碎10‑30min，得到破碎细胞液；离心步骤：所述破碎细胞液在温度为2‑8℃、离心力为2000‑5000g的条件下离心10‑30min，离心后取上清液；纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/5‑1/10的浓缩液；利用中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。本发明方法克服了现有技术提取干细胞生物活性因子的纯度低、产量少、活性低、效率低、产率低等问题；得到的干细胞裂解液具有良好的促进间充质干细胞增殖的能力和促进胶原蛋白合成的能力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是指一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法。

背景技术

干细胞作为新兴的种子细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，移植干细胞能自我更新并可分化成多种细胞，对组织进行修复；且干细胞可以产生或分泌大量的生物活性因子，这些生物活性因子在功能上主要可分为免疫调节、抗细胞凋亡、血管发生、支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、抗瘢痕六大类。它们通过自分泌或旁分泌的方式，改善局部微环境，促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分化，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。例如间充质干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，这些因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。

从上可知，利用干细胞产生的生物活性因子激活机体干细胞，通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。目前，实际中提取干细胞生物活性因子的方法存在以下不足：(1)直接利用胎盘等组织提取，获得的活性蛋白中含有大量的组织蛋白难以去除，得到的干细胞生物活性因子纯度低；(2)利用干细胞扩增培养液提取活性因子，需要浓缩大量的培养液，费时费力，且培养液中含有的活性因子浓度相对较低，即提取的效率低、产率低；(3)干细胞内含有丰富的生物活性物质，对干细胞的增殖分化等有重要作用，但在增殖分化过程这类物质并不分泌到细胞外。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：制备得到含有细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等生物活性因子的高浓度人源间充质干细胞裂解液。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，包括以下步骤：

破碎步骤：利用60-100W超声波将收集得到的融合度达到80-90％的人源脐带充质干细胞进行超声破碎10-30min，得到破碎细胞液。

离心步骤：所述破碎细胞液在温度为2-8℃、离心力为2000-5000g的条件下离心10-30min，离心后取上清液。

纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/5-1/10的浓缩液；利用中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。

进一步的，在所述破碎步骤中，所述超声破碎的超声交替地作用1-5s、停止2-6s。

进一步的，在所述纯化步骤中，所述中空纤维超滤柱的截留分子量为100KD。

进一步的，在所述破碎步骤中，所述人源脐带充质干细胞为经过0.9％氯化钠注射液重悬后浓度为5×10⁶-1×10⁷个/ml的P5代人源脐带间充质干细胞。