[发明专利]基于木瓜蛋白酶为模板的荧光铂纳米簇、制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于木瓜蛋白酶为模板的铂纳米簇及其制备方法和应用。其具体包括如下步骤：将木瓜蛋白酶溶液与高价铂配合物的水溶液进行混合，然后加NaOH溶液调节pH值为8～13，避光水浴反应完全后即得。本发明制备的铂纳米簇对溶菌酶响应灵敏，检测体系操作简便、可控、耗时短，可应用于尿液中溶菌酶含量的检测。本发明制备的木瓜蛋白酶铂纳米簇极大地增强了木瓜蛋白酶的活性，故该合成物质除木瓜蛋白酶原有的应用如在医药、食品、饲料、纺织等方面外，还可基于其荧光特性用于追踪木瓜蛋白酶的应用效果及检测样品中溶菌酶的含量。

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种以木瓜蛋白酶为模板的铂纳米簇及其制备方法和应用。

背景技术

木瓜蛋白酶(Papain)是一种主要来源于番木瓜青果乳汁中的巯基蛋白酶，具有水解酰胺键和酯键的特性，有很强的分解蛋白质能力，同时木瓜蛋白酶具有热稳定性好、酶活力高等特点，在医药、食品、纺织、制革等领域具有广泛的应用。木瓜蛋白酶由212个氨基酸组成，Cys25、His159和Asp158三个氨基酸构成了它的催化三联体，另外六个半胱氨酸残基组成了三对二硫键，且都不在活性位点上。我国广东、广西、海南、云南、福建、四川、贵州及台湾等省具有丰富的番木瓜资源，但尚未充分加以利用。因此，为了充分利用我国丰富的番木瓜资源，拓展木瓜蛋白酶的应用具有一定的意义。

探针技术与一般的检测方法相比具有专一性强、灵敏度高、快速准确等特点，这些特点使得探针技术成为现代科学技术不可或缺的重要检测手段。作为新一代荧光标记材料，金属纳米簇以其易于合成、超小尺寸、良好的生物相容性以及生物相容好等优点备受研究者关注。其中铂纳米簇作为近年来发展起来的荧光探针中的一种，在食品、环境、医学等检测领域发挥了重要作用。

溶菌酶是一种结构清楚、化学性质稳定、来源广泛的酶，已成为一种模式蛋白应用于研究生理条件的变化对于蛋白质结构功能的影响，并逐渐应用于人类疾病的研究上。例如通过监测尿液中溶菌酶的含量，可以初步鉴别肾小管疾病、急性单核细胞白血病等病症。但是怎样高效、简便地检测尿液中的溶菌酶含量是目前需要解决的一大难题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种生物相容性好、光稳定性强的木瓜蛋白酶-铂纳米簇，本发明还提供了纳米簇的制备方法和应用。本发明的木瓜蛋白酶-铂纳米簇荧光信号强且稳定，制备方法简便易操作。其既可以追踪木瓜蛋白酶的应用效果，又可以应用于溶菌酶的定量检测，检测方法简便、快捷、高效、易实现。

本发明的一种荧光铂纳米簇，所述纳米簇以木瓜蛋白酶作为模板和还原剂。

优选纳米簇的粒径小于5nm，其荧光最大激发波长为380nm，最大发射波长为490nm。

本发明还提供了所述的荧光铂纳米簇的制备方法，所述方法为将木瓜蛋白酶的水溶液与高价铂配合物的水溶液进行混合，然后加NaOH溶液调节pH值为8～13，避光水浴反应完全后即得。

本发明所述高价铂配合物为六氯铂酸(H₂PtCl₆)、六氯铂酸盐、四氯铂酸或四氯铂酸盐中的任意一种或多种组合。进一步优选所述高价铂配合物为H₂PtCl₆。

更具体的，本发明所述铂纳米簇的制备方法包括如下步骤：

(1)制备25-50mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液；

(2)制备浓度为25-100mM的H₂PtCl₆的水溶液；

(3)将H₂PtCl₆溶液加入木瓜蛋白酶水溶液中，使其中的木瓜蛋白酶与H₂PtCl₆两者的摩尔比为1.5:1-10.5:1，充分混匀；