[发明专利]一种区分ASFV野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料及试剂盒

权利要求书

1.一种非疾病诊断治疗目的的用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料，包括以下3组上游引物、下游引物和特异性荧光探针，

A组：

上游引物ASFV-P72-F：

TTTAATGAGAACGTGAACCTTGCT（SEQ ID NO：1）；

下游引物ASFV-P72-R：

ATGGTTTAAAGCGTATATTGCGTCT（SEQ ID NO：2）；

特异性荧光探针ASFV-P72-P：

荧光基团-TCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAG-淬灭基团（SEQ ID NO：3）；

B组：

上游引物ASFV-CD2V-F：

CCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAG（SEQ ID NO：4）；

下游引物ASFV-CD2V-R：

ACATGGTTTAGGTGGAGGACAT（SEQ ID NO：5）；

特异性荧光探针ASFV- CD2V-P：

荧光基团-TGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACC-淬灭基团（SEQ ID NO：6）；

C组：

上游引物ASFV-360-505R-F：

GGTTCGGATACAGGCGTTAAG（SEQ ID NO：7）；

下游引物ASFV-360-505R-R：

CTAGTAAAGGCCGTGAAGAGC（SEQ ID NO：8）；

特异性荧光探针ASFV-360-505R-P：

荧光基团-TCCGCACACAGCCGCTTTAGATACACG-淬灭基团（SEQ ID NO：9）。

2.根据权利要求1所述的检测材料，其特征在于，特异性荧光探针的荧光基团选自FAM、Cy5、HEX，且3组特异性荧光探针的荧光基团各不相同；特异性荧光探针的淬灭基团选自BHQ1、BHQ3。

3.一种非疾病诊断治疗目的的区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测材料。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、荧光定量PCR扩增试剂、阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒P72、CD2V以及360-505R基因扩增序列的质粒DNA；所述阴性对照品为去离子水。

6.一种非疾病诊断治疗目的的三重荧光定量PCR鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 从样品中提取病毒核酸；

S2. 以步骤S1中提取的核酸为模板，采用权利要求1中所述的检测材料对样品进行三重荧光定量PCR扩增反应；

S3. 根据PCR扩增曲线及Cp值，确定病毒类型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述三重荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括：2×Premix 10μL，10μM的A、B、C三组引物各0.4μL、10μM探针ASFV-P72-P、ASFV- CD2V-P和ASFV-360-505R-P各0.8μL，模板DNA2μL，补加去离子水至20μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述三重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：

95℃ 30秒，升降温速率4.4℃/s；

95℃ 5 秒，升降温速率4.4℃/s，

60℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s，共40个循环；

50℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：

当A、B、C三组引物和探针对应的荧光通道均无扩增曲线或Cp值38时，样品中没有非洲猪瘟病毒；

当A、B、C三组引物和探针对应的荧光通道均有扩增曲线，且样品Cp值不大于35时，样本中的非洲猪瘟病毒为野毒株；

当A和B组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，C组引物和探针对应荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失360-505R基因；

当A和C组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，B组引物和探针对应的荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失CD2V基因；

当A组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，B和C组引物和探针对应的荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失CD2V和360-505R基因。