[发明专利]一种区分ASFV野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料及试剂盒

说明书

本发明公开了一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360‑505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料及试剂盒，检测材料包括引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～9所示。本发明利用三组引物探针进行三重荧光定量PCR扩增非洲猪瘟病毒P72、CD2V和360‑505R基因，减少了鉴定不同基因的检测成本和检测时间；可以辨别毒株是否存在基因的缺失，且具有良好的特异性及灵敏度。对于传统qPCR，每次仅扩增一个基因来说，本发明每次PCR反应同时扩增3个基因，成本降低了约2/3。

技术领域

本发明涉及病毒株鉴别技术领域，更具体地，涉及一种区分ASFV野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)，可引起急性出血热，导致猪的大量发病率和死亡率事件(死亡率接近100%)。世界动物卫生组织 (OIE) 将其列为必须报告动物疫病, 我国将其列为一类动物疫病。从2018年第一例非洲猪瘟在我国爆发来，非洲猪瘟对我国养猪业造成重大的损失，严重影响我国的养猪业的健康发展。非洲猪瘟疫情已经扩散到亚洲多个国家。非洲猪瘟对我国乃至亚洲国家的影响将会持续很长时间。

非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175~215nm，基因组全长170~190kb，含有151个开放阅读框，可编码150~200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。

目前CN110093324A公开了一种可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法，采用非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得MGFMGF360-505R缺失和CD2V与MGFMGF360-505R联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。但该疫苗的使用会导致常规方法检测非洲猪瘟病毒结果钧为阳性，无法区分野毒感染致阳性，还是疫苗接种导致阳性。

近年来，国内外学者对其建立了普通PCR诊断，SYBRGreen实时荧光定量PCR等核酸技术进行ASF的检测，表现出了很高的灵敏度。但这些方法主要检测P72这个保守性衣壳蛋白基因，无法区分野毒株还是基因缺失株感染。因此本发明通过建立三重荧光定量PCR的方法，同时检测非洲猪瘟病毒CD2V，MGF360-505R和P72基因，可以有效区分野毒株还是基因缺失株感染。

发明内容

本发明第一个方面的目的，在于提供一种用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料。

本发明第二个方面的目的，在于，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明第三个方面的目的，在于提供一种三重荧光定量PCR鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速区分方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的一个方面，提供一种用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料，包括以下3组上游引物、下游引物和特异性荧光探针，

A组：

上游引物ASFV-P72-F：

TTTAATGAGAACGTGAACCTTGCT（SEQ ID NO：1）；

下游引物ASFV-P72-R：

ATGGTTTAAAGCGTATATTGCGTCT（SEQ ID NO：2）；