[发明专利]基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法及α-酪蛋白定量检测

权利要求书

1.一种基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）分别于5 mL离心管中加入0.03 mL 1 mg/mL磷酸化程度不同的蛋白质溶液, 0.1 mL1 mg/mL Zr-MOF纳米酶和0.267 mL醋酸盐缓冲液，反应1～15 min；所述磷酸化程度不同的蛋白质为α-酪蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白、甜蛋白、清蛋白、乳铁蛋白和胶原蛋白；

2）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 mL 200 mM的H₂O₂，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应10～60 min；

同时，以不加蛋白质溶液的空白组做对比，处理步骤一致；

3）待测样品按步骤1）-2）进行处理，裸眼观察待测样品溶液和空白组溶液颜色的差异，对磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白进行初步的区分，比空白组颜色浅的样品组的蛋白质为磷酸化蛋白质，而且溶液越浅的样品组中的蛋白质的磷酸化程度越高；

或者，

用紫外-可见吸收分光光度计测定各组混合溶液的紫外吸收光谱，并记录波长为652nm处的吸光度，比较待测样品溶液与空白组溶液吸光度值的大小，待测样品溶液的吸光度值小于空白组吸光度值百分之十及以上的为磷酸化蛋白质，与空白组吸光度值相近或者大于空白组的为非磷酸化蛋白质；

上述Zr-MOF纳米酶，其合成方法包括如下步骤：

a)将2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸和锆盐溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中搅拌均匀形成反应混合物，加入调节剂，超声处理10min后，移入反应釜中，80～150℃加热8～18 h；其中，所述2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸：锆盐：DMF：调节剂的摩尔体积比为1mmol：1～3mmol：10～50 mL：1～5g；

b)冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和四氢呋喃(THF)洗涤后，25℃真空干燥6h得到粉红色Zr-MOF纳米酶。

2.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤1）中所述反应3 min。

3.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤1）中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2 M。

4.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤2）中所述混匀体系后反应30min。

5.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤a）中所述移入反应釜中，120℃反应12 h。

6.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤a）中所述2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸：锆盐：DMF：调节剂的摩尔体积比为1mmol：1.2mmol：20mL：2.9g。

7.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤a）中所述锆盐为ZrCl₄、ZrOCl₂或Zr(NO₃)₄；所述调节剂为乙酸、甲酸或苯甲酸。