[发明专利]基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法及α-酪蛋白定量检测

说明书

本发明属于分析化学技术领域，涉及磷酸化蛋白检测，尤其涉及一种基于Zr‑MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法。磷酸化蛋白质可以抑制3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺（TMB）的显色而非磷酸化蛋白促进或者无影响TMB的显色，本发明首先配制磷酸化状态不同的蛋白质溶液、Zr‑MOF纳米酶和醋酸缓冲液的混合溶液，再依次加入TMB和H₂O₂，待显色反应完成后，依据溶液验收差异即可区别二类蛋白。本发明还公开了基于Zr‑MOF纳米酶的α‑酪蛋白定量检测方法，其可检测浓度范围为0.17～5µg/mL，检测限低至0.16µg/mL；其他磷酸化蛋白质亦同理。本发明不仅可以定性区分磷酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质，还可以定量检测磷酸化蛋白质，成本低、灵敏度高、重复性好、检测速度快，可用于食品、医学等诸多领域。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及磷酸化蛋白检测，尤其涉及一种基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法及α-酪蛋白定量检测。

背景技术

纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。纳米酶具有催化效率高、稳定、经济和可规模化制备的特点，近年来，它逐步取代天然酶在医学、化工、食品、农业和环境等领域得到广泛应用。金属有机框架（MOFs）在许多方面得到了广泛使用，包括气体吸附和储存、分子分离、有机催化和药物的持续释放等。随着研究的深入，许多MOFs还发现了纳米酶的特性，使其具有更多的应用价值。因此合成一种具有纳米酶活性的MOFs用于分析检测具有重要意义。

蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活性和功能的最基本、最普遍、也是最重要的机制。蛋白质的可逆磷酸化过程几乎与所有生命活动密切相关，其中包括调控基因的表达和转录、蛋白质的合成和代谢的调控、肌肉收缩、肿瘤产生以及神经活动等。因此，有必要开展蛋白质磷酸化分析检测，以探索基本的生物学过程以及预防早期疾病等。

目前磷酸化蛋白质检测和区分的方法有：放射性同位素标记法、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附法、质谱法、流式细胞术等。中国专利CN109030828A《一种检测组氨酸磷酸化蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法》公开了一种酶联免疫法检测检测组氨酸磷酸化蛋白的方法，该方法操作简单，高效灵敏，易于标准化。中国专利CN106770867A《一种富集检测磷酸化蛋白的方法》公开了一种富集检测磷酸化蛋白的方法，该方法可实现复杂混合物中磷酸化蛋白高选择性、高重复性和高通量地富集检测。

然而上述方法中大多数需要使用昂贵的抗体，提高了检测成本。此外，抗体还会导致免疫组化伪像和不同表位之间的交叉反应，势必影响检测的准确性；部分方法严重依赖于大型仪器设备和专业操作，因此无法实现随时随地的快速检测。因此，开发一种低成本、无抗体、易于操作的方法来检测和区分磷酸化蛋白显得十分重要。

基于以上问题，考虑到比色法检测原理简单、操作简单、成本低廉，是一种较为理想的检测方法。而且，基于Zr-MOF纳米酶的过氧化物酶活性的分光光度法用来检测和区分磷酸化蛋白质，目前尚未见报道。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于公开了基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法。

该方法以Zr-MOF为类过氧化酶模拟物，在酸性条件下，催化H₂O₂与显色剂（TMB）之间的反应，产生显色物质（TMBox）。由于磷酸化蛋白质上的磷酸基团会与Zr-MOF上Zr特异性的结合，导致Zr-MOF上的酶活性位点被掩蔽，从而影响该类过氧化物酶催化底物的能力，导致显色物质呈现出不同的颜色变化。磷酸化蛋白质可以抑制TMB的显色而非磷酸化蛋白促进或者无影响TMB的显色，本发明基于该原理构建比色传感阵列对磷酸化蛋白质和非磷酸蛋白质进行区分。

技术方案如下：

一种基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，包括如下步骤：