[发明专利]一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法

权利要求书

1.一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取一份含有还原性单糖的溶液样品，用乙腈或丙酮进行稀释，加入乙腈或丙酮的体积是溶液样品体积的2～4倍，待溶液样品中的蛋白质沉淀后，将此溶液样品离心，离心后取上清液用于后续离子色谱的测定；

(2)离子色谱测定各种糖的标准曲线：

将阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准物分别溶于超纯水中，稀释成一系列浓度梯度，糖的浓度范围为0.1～2mg/L；

采用离子色谱确定各种糖的出峰时间、并测定其峰面积，根据已配置糖浓度建立阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准曲线；

离子色谱所用检测器、色谱柱和电极分别为脉冲安培电化学检测器、碳水化合物分析柱和金电极，淋洗液由超纯水和200～250mmol/L NaOH溶液组成，采用梯度洗脱的方式对过滤液中的各种糖进行分离和定量测定；

(3)离子色谱测定上清液中多种单糖的浓度：

用去离子水稀释上清液，然后对上清液进行过滤，按照步骤(2)中离子色谱方法测定过滤液中多种单糖的峰面积；

(4)基于步骤(2)建立的标准曲线，根据步骤(3)色谱图中各种糖的峰面积、去离子水稀释倍数和乙腈稀释倍数，计算出溶液样品中各种还原性单糖的浓度；

(5)紫外-可见光谱测定标准糖溶液的吸光度值：

将商品化的BCA试剂盒中A试剂和B试剂按体积比45∶1～50∶1进行混合，得到的BCA试剂用作蛋白质和还原性单糖的显色剂；

取浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液0.1～0.15mL、BCA试剂3～4.5mL混合后，置于30～37℃条件下中反应30～45min，反应后倒入宽度为1cm的石英比色皿中，静置后进行紫外-可见光谱的背景扫描，记录562nm波长处的吸光度值；

(6)将阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准物分别溶于浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，糖的浓度范围为0.1～8g/L；

按照步骤(5)中的方法进行紫外-可见光谱的样品扫描，记录各种还原性单糖溶液在562nm波长处的吸光度值；

根据朗伯比尔定律，建立标准物溶液的浓度及其在562nm波长处吸光度值之间的线性标准曲线：

其中，为某种糖在562nm处的吸光度值；为某种糖在562nm处的摩尔吸光系数，L/g；C_Sugar为配置的某种糖的浓度，g/L；

根据测定的吸光度值和配置的糖浓度，某种糖在562nm处的摩尔吸光系数根据等式1进行计算；

(7)紫外-可见光谱测定溶液样品中花生蛋白质的浓度：

另取一份含有还原性单糖的花生蛋白质溶液样品，经浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释5～20倍后，根据步骤(5)和(6)的方法测定溶液样品中水溶性花生蛋白质和还原性单糖在562nm处的总吸光度值

在某一波长处，根据不同物质对吸光度所产生的贡献存在叠加原理可知：

其中，为溶液样品在562nm处的总吸光度值；和分别为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和水溶性花生蛋白质在562nm处的吸光度值；

根据步骤(4)所测定出溶液样品中各种还原性单糖的浓度及等式1，溶液样品中水溶性花生蛋白质在562nm处的净吸光度值计算如下：

其中，和分别为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖在562nm处的摩尔吸光系数；C_Ara、C_Gal、C_Xyl、C_Glu和C_Man分别为步骤(4)所测定出溶液样品中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的浓度；

(8)溶液样品中水溶性花生蛋白质的浓度：

将一定质量的牛血清蛋白溶于浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，并经相同的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释一定倍数，采用步骤(5)和(6)的方法测定不同浓度牛血清蛋白溶液在562nm处的吸光度值，根据朗伯比尔定律建立其标准曲线，计算其摩尔吸光系数

在未扣除单糖干扰的情况下，基于牛血清蛋白的摩尔吸光系数溶液样品中水溶性花生蛋白质浓度采用下式进行计算：

为避免单糖的干扰，结合等式3及牛血清蛋白的摩尔吸光系数，溶液样品中水溶性花生蛋白质浓度根据下式进行计算：

其中，C_PP为溶液样品中水溶性花生蛋白的浓度，g/L；为牛血清蛋白在562nm处摩尔吸光系数，L/g；

所述含有还原性单糖的溶液为脱脂花生粉提取液；所述脱脂花生粉提取液的制备，包括以下步骤：

(a)将一定体积的醋酸-醋酸钠缓冲液和一定质量的半纤维素酶加入到容器中溶解；

(b)往容器中加入一定质量的脱脂花生粉，置于45～55℃环境中进行蛋白质提取；提取结束后进行离心分离，取上清液作为脱脂花生粉的粗提取液；

(c)将步骤(b)中的粗提取液在85℃条件下加热15min，然后离心去除变性沉淀的半纤维素酶，取上清液作为脱脂花生粉提取液；

提取花生粕中水溶性花生蛋白质所用溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液浓度和pH值范围分别为40～50mmol/L、4.5～6.0。