[发明专利]对免疫细胞进行细胞数、活力或凋亡测定的高精密度方法

说明书

本发明提供了一种对免疫细胞进行细胞数测定、活力测定或细胞凋亡测定的高精密度方法。本发明提供了一种新的对免疫细胞进行计数(浓度、活率，细胞凋亡功能检测)的方法，可应用于基于免疫细胞治疗为基础的一系列功能检测研究。本发明的方法成本低廉，为小型实验室和诊所进行免疫细胞相关研究，尤其为在无法获得流式细胞仪、激光扫描仪和荧光显微镜或需要快速分析数据的场景下的检测提供了一种快速、简单且廉价的检测手段。

技术领域

本发明属于细胞学领域，更具体地，本发明涉及对免疫细胞进行细胞数测定、活力测定或细胞凋亡测定的高精密度方法。

背景技术

免疫细胞治疗是一种新兴的治疗方式，是被认为最有前途的癌症治疗方法之一。其中，嵌合抗原受体(CAR-T)细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。目前在全球已有两款药物获得FDA的批准上市，分别是诺华的Kymriah和凯特的Yescarta，全世界有多家公司产品进入临床申报阶段，这种疗法已成为许多患者的选择。

免疫细胞作为“活”的药物，其浓度活率是产品的重要指标之一，FDA 在2011年颁布的法规(Guidance for industry:Preclinical Assessment of InvestigationalCellular and Gene Therapy Products)要求对细胞的浓度活率进行监控；另外免疫细胞培养过程中，对浓度活率的准确监控，有助于了解细胞状态，优化细胞培养方案。

免疫细胞不同于其它细胞的特点是：免疫细胞直径比较小，大概在 9-12um，在细胞因子的刺激下容易分化，不易准确计数。在培养过程中，免疫细胞也存在着生长缓慢，不易培养等问题。

现有技术中，动物细胞活力测定的方法主要分为2大类，一种是基于台盼蓝(TB)细胞活力测定方法，即细胞样品用台盼蓝染色后，基于血细胞计数器和基于成像的细胞计数仪进行测定。第二种是，基于荧光染料(比如与核酸结合的荧光染料：DAPI，Hoechst 33342，ethidium bromide(EB)，propidium iodide(PI)，SYTOX green/red等，酶催化染料：acridine orange(AO)，calcein AM和CFDA等)的细胞活力测定法，细胞样品用荧光染料染色后，进一步用流式细胞仪和基于成像的荧光细胞计数仪来测定。基于荧光染料的细胞活力测定方法，由于荧光染料是要么与核酸结合，要么需要进入细胞，被细胞内酶催化产生荧光，从而可实现细胞的计数。目前，有一些自动化的荧光成像细胞计数仪，能够快速进行细胞计数，捕捉明场和荧光下细胞图片，进行视觉确认。目前已有相关仪器用于免疫细胞培养过程中浓度和活力测定，比如 Cellometer Vision(Nexcelom Bioscience)，Tali(Invitrogen)，NucleoCounter (Chemometec)。

但是，本领域中还存在细胞计数和分析方面的一些缺陷：一方面，不同的染料对于不同的细胞对象的染色效果存在不确定性，使得研究过程中存在计数不准的问题；另一方面，现有的计数仪器对于不同的应用场景、不同的检测目标，还存在不稳定性。例如，对于外周血单个核细胞(PBMCs)此类免疫细胞，在研究过程中发现，当应用常规的计数以及常规染色条件时，染色效果不理想、检测误差较大，甚至还有检测过程中细胞状态不理想的情况，难以找到较为理想的检测条件。

本领域中，也会采用常规的基于流式细胞仪的细胞活力测定，特别是应用于测试细胞凋亡。流式细胞仪可同时针对百万级别的细胞进行计数，减少统计学误差，但是流式细胞方法的检测在实践中也常遇到染料运用不当导致检测精密度不稳定的问题；同时，流式细胞仪成本高昂，仪器维护成本也很高，而且对用户操作技能要求较高，使得一些小型实验室或中小医院等检测机构望之却步。此外，流式细胞仪没有成像结果，无法对异常结果进行判定，而无法满足大多数用户的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供对免疫细胞进行细胞数测定、活力测定或细胞凋亡测定的高精密度方法。