[发明专利]一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法

权利要求书

1.一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，其特征在于，将上游引物探针设计为双链引物，采用双链引物介导的链置换反应进行不对称PCR，生成单链DNA；

所述上游引物探针的末端分别标记有荧光基团和淬灭基团，

所述上游引物探针的荧光基团标记序列为：

5’-FAM-ATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3’，

所述上游引物探针的淬灭基团标记序列为：5’-CAGTTGACCCTGTAAT-BHQ-3’；

下游引物的序列为：5’-CCCAATCCCCCAGCAGGCTCCG-3’；

检测探针的序列为：

5’-SH(CH2)₆-CAGGCAAACTCTGAACTGA-methylene blue-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增程序包括如下步骤：

(1)预变性；(2)若干个变性、引物退火和引物延伸的PCR扩增。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：扩增产物的长度为150-300nt。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述上游引物探针与下游引物的摩尔比为(4-10):1。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的循环数为30-50个。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法在鉴定乙醛脱氢酶2上的应用，其特征在于：包括如下步骤：

(1)人全血基因组核酸的提取；

(2)设计并合成ALDH2的特异性引物和探针：

上游引物探针为末端标记有荧光基团和淬灭基团的双链引物，所述上游引物探针的荧光基团标记序列为：5’-FAM-ATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3’，所述上游引物探针的淬灭基团标记序列为：5’-CAGTTGACCCTGTAAT-BHQ-3’；

下游引物的序列为：5’-CCCAATCCCCCAGCAGGCTCCG-3’；

检测探针的序列为：5’-SH(CH2)₆-CAGGCAAACTCTGAACTGA-methylene blue-3’；

(3)不对称PCR扩增反应：

①构建PCR反应体系：去离子水20μL，2*HiFi-PCR Master 25μL，DNA模板1μL，上游引物探针10μmol/L、2μL，下游引物2μmol/L、2μL；

②PCR扩增程序包括如下步骤：95℃，预变性3min；95℃，变性3s；95℃，退火15s；

72℃，延伸15s；30-50个循环；

(4)乙醛脱氢酶2基因型结果判断：将捕获探针固定在金电极上，得到探针修饰的金电极，所述捕获探针能与野生型单链靶基因杂交的捕获探针，且捕获探针末端标记有MB电化学活性分子，采用所述金电极制备电化学生物传感器，并将步骤(3)得到的扩增产物滴加在所述电化学生物传感器上，采用方波伏安法检测不对称PCR扩增的ALDH2单链靶基因的基因型，不产生信号的变化的为突变型单链靶基因，产生电流信号的变化的为野生型单链靶基因。