[发明专利]一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法

说明书

本发明属于分子生物技术领域，具体公开了一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，本发明通过双链引物介导的链置换反应，将上游引物设计为双链引物，该引物末端分别标记荧光基团和淬灭基团，这样设计减少了体系的复杂性，增加了引物的特异性并提高了单链DNA的产量，通过荧光强度的积累可以直观的判断出不对称PCR的指数扩增期和线性扩增期。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNPs)是单个核苷酸的改变所引起的DNA序列多态性，是人类基因组中最常见、最稳定的变异形式。人类基因组中存在着约30-1000万个SNPs位点，这些SNPs影响着人类对疾病的易感性以及对病原体、化学品、药品、疫苗等的反应。因此SNPs的检测在疾病的风险性评估、诊断、治疗，实现精准医疗等方面均有巨大的价值。

近年来发展的基于核酸扩增和杂交的核酸快速检测技术为SNPs的检测、精准医疗的实施提供了新的契机，其核心包括：获得大量具有杂交活性的靶基因以实现临床样本的高灵敏检测；获得与靶基因相匹配的特异检测探针以实现检测信号的准确输出。

核酸扩增是获得大量具有杂交活性靶基因的主要技术，如聚合酶链式反应(PCR)，依赖解旋酶的等温扩增(HDA)，环介导核酸等温扩增(LAMP)，链替代扩增(SDA)，切刻内切酶核酸恒温扩增(NAR)等。这些技术的发展为从低拷贝样本中获得大量靶基因提供了可能。

不对称PCR、核酸外切酶处理法、变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离法和磁珠捕获法是获得具有杂交活性靶基因最有效的几种方法。核酸外切酶处理法用核酸外切酶作用于扩增的双链DNA，从羟基末端方向逐步水解单核苷酸，从而在DNA双链内部发生碱基渐进缺失的过程，最终产生大量的单链靶基因；变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离法利用扩增产物链长度差异，经变性电泳分离达到获得单链靶基因的效果；磁珠法通过链霉亲和素包被的磁珠捕获生物素标记的扩增产物，然后用NAOH处理获得单链DNA；上述方法均需对PCR产物进行额外的后处理，操作不便，且成本高。不对称PCR用不等量的引物经指数扩增和线性扩增两个阶段来扩增大量的单链靶基因，但这种方法需要优化上下游引物的量，操作繁琐，还可能会产生非特异性目标条带，导致引物特异性低。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，用于解决现有的用于制备单链扩增产物的方法操作复杂、引物特异性低、单链DNA不易获得等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种链置换引物介导不对称PCR生成单链DNA的方法，将上游引物探针设计为双链引物，通过双链引物介导的链置换反应介导不对称PCR，生成单链DNA。

可选地，所述上游引物探针的末端分别标记有荧光基团和淬灭基团。

可选地，所述方法包括如下步骤：

(1)预变性；(2)若干个变性、引物退火和引物延伸的PCR扩增。

可选地，所述上游引物探针的荧光基团标记序列为：5’-FAM-ATTACAGGGTCAACTGCTATGA-3’，所述上游引物探针的淬灭基团标记序列为：5’-CAGTTGACCCTGTAAT-BHQ-3’；所述下游引物的序列为：5’-CCCAATCCCCCAGCAGGCTCCG-3’。

可选地，检测探针的序列为：5’-SH(CH2)6-CAGGCAAACTCTGAACTGA-methyleneblue-3’。

可选地，所述扩增产物的长度为150-300nt。

可选地，所述上游引物与下游引物的摩尔比为(4-10)∶1。

可选地，所述PCR扩增的循环数为30-50个。