[发明专利]基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法

说明书

本发明公开一种基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，包括从朱砂烟种子库中选种育苗；出苗到生长30～40d且长至30～40cm高后选底部第2至第4片状态良好烟叶取样；将取样置于乙烯利+脱落酸混合溶液中浸润后打孔，将打孔后剩余烟叶干燥至表面无水分；将无水分烟叶烘干至恒重；用化学分析烟叶的烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化率；检测打孔烟叶CYP82E4基因表达；根据烟碱转化率和CYP82E4基因表达，筛选出符合烟碱定量转化率的烟株培植，同时去掉转化率不符烟株；将筛选出的烟株套袋至成熟留种，即得到烟碱定量转化率的朱砂烟种子。本发明具有稳定可靠、筛选速度快、准确率高、种子烟碱转化率可控等特点。

技术领域

本发明属于烟草种子预筛技术领域，具体涉及一种稳定可靠、易操作、筛选速度快、准确率高、种子烟碱转化率可控的基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法。

背景技术

朱砂烟是指烤后烟叶外观呈现中药的朱砂色，俗称“朱砂”烟叶。朱砂烟虽然稀少，但其在烟叶生产历史中是客观存在，如国外上世纪研究资料因其颜色与车厘子相似，故称“樱桃红（Cherry-Red）”烟叶。

常规烟叶烟碱主要由烟碱（化学名称叫尼古丁）、降烟碱（去甲基烟碱）、麦斯明、假木贼碱、可替宁、新烟草碱、尼可他因、联吡啶等八种碱性物质总合组成，统称生物碱，也称总烟碱。一般的栽培烤烟品种，烟碱含量占其总生物碱含量的93%以上，降烟碱含量一般不超过总生物碱含量的3.5%，但在栽培烤烟品种的烟株群体中，一些烟株在田间由于某些生态因子作用下而发生基因突变而出现烟碱去甲基化，烟碱转化成去甲基烟碱，即降烟碱，导致烟碱含量显著降低，降烟碱含量相应增加，这种具有烟碱向降烟碱转化能力的烟株被称为转化株（Converter），朱砂烟就是典型转化株。在天然条件下，这种突变株出现的概率很低，约为0.5%。

朱砂烟烟碱主要是降烟碱，占其总生物碱含量的50%以上，甚至达到90%或更高，尼古丁大量转化为降烟碱，尼古丁生物碱含量只有40%左右，有的不到10%。总烟碱不变、低尼古丁、高降烟碱，造就了朱砂烟口感舒适愉悦独特、劲头适中、烟香浓厚、刺激小，杂气轻、道地云南烟叶的品质优势，深受烟民青睐，是最具“三感”特色的烟叶（满足感、舒适感、轻松感），但在广大烟区朱砂烟只有零星出现，属于可遇不可求的天然现象。

朱砂烟遗传属于表观遗传，烤烟中发生朱砂烟的主要原因是CYP82E4基因受到诱导而发生强烈表达，从而使烤烟中烟碱向去甲基烟碱发生转化。基因主效、环境互作、中上部典型，决定表观性状的基因功能表达，并且是可稳定遗传。根据相关信息综合判断，随着代数增加，朱砂烟烟碱转化率逐步增加，即大部分烟碱转化成去甲基烟碱造成烟碱含量下降。

目前，我国尚无烟碱定量转化率的烤烟朱砂烟种子筛选方法。在已有云烟97-朱砂烟与云烟87-朱砂烟的种子库资源下，为满足各大烟区的推广生产以及烟民需求，便于科学制定朱砂烟的鉴定标准和指导评级收购，保障筛选提纯留种种子纯度与便于管理，急需通过对不同烟碱转化率的朱砂烟种子进行筛选，从而全面提升烤烟原料保障能力与核心竞争力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种稳定可靠、易操作、筛选速度快、准确率高的基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法。

本发明是这样实现的：包括选种育苗、培植取样、前处理、55℃烘干至恒重、烟碱分析、基因检测、烟株筛选、培植取种步骤，具体步骤如下：

A、选种育苗：从不同烟碱转化率的朱砂烟种子库里选择种子进行育苗；

B、培植取样：从出苗开始待烟株生长30～40d且生长至30～40cm高度后，选取烟株底部第2至第4片叶中状态良好的烟叶作为取样叶片；

C、前处理：将取样的烟叶置于乙烯利与脱落酸的混合溶液中浸润后，采用打孔法采集鲜烟叶样品用于基因表达检测，将剩余烟叶干燥至表面没有游离的水分；