[发明专利]一种SUMO-CP融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法有效

专利信息
申请号: 201911141667.2 申请日: 2019-11-20
公开(公告)号: CN110845624B 公开(公告)日: 2022-04-29
发明(设计)人: 龚斌 申请(专利权)人: 北部湾大学
主分类号: C07K19/00 分类号: C07K19/00;C07K16/08;C07K16/06;C07K1/22;C12N15/70
代理公司: 桂林市持衡专利商标事务所有限公司 45107 代理人: 唐智芳
地址: 535011 广西壮族自*** 国省代码: 广西;45
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摘要:
搜索关键词: 一种 sumo cp 融合 蛋白 及其 制备 方法 克隆 抗体
【说明书】:

发明公开了一种SUMO‑CP融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法。所述SUMO‑CP融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其制备方法包括以下步骤:1)根据HPV病毒衣壳蛋白CP的核苷酸序列设计正反向引物并进行PCR扩增,所得PCR产物与pSUMO载体连接,转化DH5α,筛选阳性工程菌并提取质粒做双酶切及DNA测序验证,得到pSUMO‑sHPVCP重组质粒;2)所得重组质粒转染Rossetta(DE3),得到诱导表达蛋白的菌液;3)所得菌液离心,沉淀经裂解破碎后再离心,沉淀再经溶解、透析后,上镍亲和层析柱纯化,即得。由上述融合蛋白免疫兔子所得的抗HPV‑CP多克隆抗体效价高。

技术领域

本发明涉及一种SUMO-CP融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法,属于医学免疫技术领域。

背景技术

对虾肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovirus,HPV)是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一。HPV可感染10多种对虾,病毒侵染处于幼体和稚虾期的中国对虾(Penaees chinensis)及处于幼体期的墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)、短沟对虾(Penaeessemisulcatus)等,会使幼虾在感染的4-8周死亡率达到50-100%。HPV的感染还与对虾生长停滞有关,使其最终长到6cm就停止生长,造成较大的经济损失。有该病毒报道存在的地理位置很广泛,从东非到韩国,包括澳大利亚、太平洋以及美国的大西洋海岸一带,中国、新加坡、科威特、菲律宾、印度尼西亚、朝鲜及泰国等均有相关对虾HPV的报道。

对虾HPV病毒在分类学上归为细小病毒科(Parvoviridae)、浓核症病毒亚科(Densovirinae),病毒基因组为单股负链DNA,长约为6kb。HPV基因组有3个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),分别编码非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)和结构蛋白(Capsid protein,CP)。cp基因主要编码病毒的衣壳蛋白,是刺激机体产生免疫反应的成分,还可能与病毒的毒力及致病性有关。采用基因工程方法表达对虾HPV病毒衣壳蛋白并制备抗体,对于HPV病毒的致病机理研究、免疫制剂及诊断试剂的研究均具有很重要的意义。2006年Sukhumsirichart报道从泰国斑节对虾(Penaeus monodon)中分离的HPV病毒CP蛋白应该由一个编码818个氨基酸(大小92KD)的ORF3翻译得到,但是直接从纯化的病毒颗粒中检测的外壳蛋白的大小为57KD以及一个很弱的54KD的蛋白。据分析由ORF3翻译得到的蛋白靠近N端有一个序列在细小病毒中是非常保守的蛋白酶切位点,在此位点的选择性切割刚好能得到一个57KD和54KD的蛋白(Sukhumsirichart W,Attasart P,Boonsaeng V,etal.Complete nucleotic sequence and genomic organization of hepatopancreaticparvovirus(HPV)of Penaeus monodon.Virology,2006,346:266–77.)。2011年泰国Chutima报道尝试在大肠杆菌中表达57KD的外壳蛋白失败,他们分别做了N端和C端截短表达的GST融合蛋白,大小分别为67.2和56.7KD,并制备了单克隆抗体用于HPV的检测(Chutima S,Parin C,Wasana S,et al.Improved immuno detection of Penaeusmonodon densovirus with monoclonal antibodies raised against recombinantcapsid protein.Aquaculture,2011,311:19-24.)。2013年印度N.Madan报道利用HPV印度株相关序列克隆并在大肠杆菌中表达了一个34KD的重组外壳蛋白rHCP并制备了抗血清(Madan N,SundarRaj N,Farook M A,et al.Partial cloning and production ofpolyclonal antiserum against recombinant capsid protein of Hepatopancreaticparvovirus(HPV)and its application for diagnostics in penaeid shrimp.ProcessBiochemistry,2013,48:1893-1898.)。综上所述,由于各种原因,采用基因工程的方法表达cp基因并获得全长的CP蛋白是一个还没有克服的难题。

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