[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种β‑葡萄糖苷酶及其制备方法与应用。本发明所公开的β‑葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所公开的制备方法包括基因组DNA的提取、目的基因扩增、载体构建、转化、表达和纯化。本发明的β‑葡萄糖苷酶比活力达到了59.19μkat/g，约为3550U/g，高于经传统方法表达的β‑葡萄糖苷酶的比活力，且热稳定性和pH稳定性良好，可用于葡萄酒酿制。

技术领域

本发明涉及生物制酶技术领域，特别是涉及一种酒类酒球菌来源的β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶作为一种关键的糖苷水解酶，在葡萄酒增香的过程中扮演着重要的角色，但是β-葡萄糖苷酶的制备方法繁琐，费时费力，产量低下，难以满足生产要求。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之一是提供一种β-葡萄糖苷酶。

本发明所提供的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

同时本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的制备方法。本发明所提供的制备方法包括以下步骤：

(1)基因组DNA的提取：提取酒类酒球菌SD-2a的基因组DNA；

(2)目的基因扩增：以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应，扩增目的基因；

(3)载体构建：将扩增得到的目的基因插入表达载体PcoldI构建表达质粒PcoldI-0224；

(4)转化：将表达质粒PcoldI-0224导入大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到转化子；

(5)表达：将转化子进行扩大培养，提取培养物中的重组表达质粒PcoldI-0224导入感受态细胞BL21，之后进行扩大培养；

(6)纯化：对步骤(5)的培养物依次进行裂解、过滤，之后依次采用His重力镍柱和超滤管收集β-葡萄糖苷酶。

优选的，本发明制备方法中步骤(1)中提取对数中期酒类酒球菌SD-2a的基因组DNA。

优选的，本发明制备方法中步骤(2)扩增时所用引物序列分别为：

上游引物：5’-CTCCATATGATGAATAAACTTTTTTTGCCGAAA-3’，

下游引物：5’-TGAGGATCCTTAATCTAATTGACTGCCGTTTGA-3’。

优选的，本发明制备方法步骤(2)中所用的DNA聚合酶为PrimeSTAR Max DNAPolymerase，PCR反应程序为：95℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸60s，30次循环；72℃保温8min。

本发明的β-葡萄糖苷酶可用于酿制葡萄酒，相比于现有的同类酶，该酶的催化性能增加，在用于酿制葡萄酒时，可增加酒中香气物质的种类和含量、改善葡萄酒的风味、提高葡萄酒产品质量。

与传统方法相比，本发明直接将目的基因与表达载体双酶切后在DNA连接酶的作用下连接，不必经过传统的T-A克隆程序，极大地节省了时间。

本发明重组酶的比活力达到了59.19μkat/g，约为3550U/g，高于经传统方法表达的β-葡萄糖苷酶的比活力，且热稳定性和pH稳定性良好。

附图说明

图1为本发明实施例中制备的β-葡萄糖苷酶和酒酒球菌PSU-1中的β-葡萄糖苷酶蛋白序列比对；

图2为本发明实施例中表达质粒PcoldI-0224的构建过程图；