[发明专利]单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法及其应用

说明书

本发明公开一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法及其应用。通过该方法成功挖掘到多种血清型特异性SNP。将不同血清型特异性SNP组合使用，通过将血清型特异性SNP置于引物的3′末端，使某种血清型高效扩增，而其他血清型扩增效率极低，达到区分出主要血清型的目的，另外，通过同时使用某一基因的两个SNP区域设计两个特异性引物，再设计一条共用引物，可以三条引物区分两种型，最大化节省引物的数量。因此，本发明从特异性碱基出发开发了一种用于鉴定单增李斯特菌主要血清型的方法，且相比现有的多重PCR方法实现了引物用量的减少，且准确率较高，与Doumith的方法对比，对60株单增李斯特分型一致性达100％。

技术领域

本发明属于致病微生物血清型鉴定检测领域，涉及一种以血清型特异性SNP为基础开发的多重PCR检测单增李斯特主要血清型的方法，具体涉及一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法及其应用。

背景技术

单增李斯特菌是一种人畜共患致病菌，常引起严重的食品安全问题，人类受感染后可造成脑膜炎、败血症、流产等症状，对老人、孕妇、儿童等免疫低下者会造成严重的后果，致死率达20％～30％(参考文献：Radoshevich L,Cossart P.Listeriamonocytogenes:towards a complete picture of its physiology andpathogenesis.Nature Reviews Microbiology.2018,16(1):32-46)。该菌抗逆性较强，可在低温(4℃)、高盐环境下生长，常在鸡肉、鱼肉、牛肉等食品中分离到该菌，是重点监控的食源性致病菌。近几年随着我国饮食结构的变化，生食、快餐的大规模食用也会增加单增李斯特菌的爆发风险，对单增李斯特菌的溯源、监控也变得尤为重要。

截止目前，单增李斯特菌共检测到13种血清型，其中1/2a、1/2b、1/2c、4b型是最常见的四种型，从临床和食品中分离的单增李斯特菌中该四种型占到95％以上。传统的血清型鉴定方法是针对菌体表面的O抗原和H抗原的差异，采用血清分型试剂盒进行鉴定，该方法费时费力且价格昂贵。基于PCR的分子分型方法快速、廉价、高通量可弥补血清试剂盒分型的不足，现阶段已有许多关于单增李斯特菌血清分型的分子分型方法，多是通过筛选血清型特异性基因，采用PCR的方法实现对单增李斯特的血清分型。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法。通过该方法成功挖掘到多种血清型特异性SNP(单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphism)。将不同血清型特异性SNP组合使用，用等位基因特异性多重PCR的方法，达到区分出主要血清型的目的，并且可最大化节省引物的数量。

通过将血清型特异性SNP置于引物的3′末端，使某种血清型高效扩增，而其他血清型扩增效率极低，从而实现血清分型的目的，另外，通过同时使用某一基因的两个SNP区域设计两个特异性引物，再设计一条共用引物，可以三条引物区分两种型，最大化节省引物的使用量。

本发明的另一目的在于提供一种用于单增李斯特菌血清型多重PCR分型的引物组。

本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定单增李斯特菌主要血清型的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述引物组或试剂盒的应用。

本发明的再一目的在于提供一种用于鉴定单增李斯特菌主要血清型的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法，包括如下步骤：

(1)首先从NCBI的biosample模块下载已知血清型的单增李斯特菌基因组207个，所有下载的基因组均为fasta格式，在每个基因组信息中标注血清型和编号，然后将所有207个基因组写入到一个fasta格式的文件，称为genemos；