[发明专利]一种测定气-液界面暴露下卷烟烟气细胞毒性的方法

说明书

本发明涉及烟草及烟草制品检测领域，具体涉及一种测定气‑液界面暴露下卷烟烟气细胞毒性的方法，通过将气‑液界面暴露法和噻唑蓝法(又名MTT法)联合起来对卷烟烟气导致的细胞毒性进行检测，在进行所述气‑液界面暴露法时，将细胞以0.8～1.2*10⁶个/孔的密度接种于插入式培养板(又称Transwell培养板)；以流速为8～12mL/min的烟气对细胞进行染毒处理。本发明中的检测方法能够更客观地反映人体呼吸系统接触卷烟烟气的过程，不仅提高了检测的准确性和敏感性，还减少了检测时间，更为方便快捷。同时，本发明可实现加热不燃烧卷烟和传统卷烟烟气的细胞毒性的评价，相比现有技术覆盖面更广，操作简单，结果更全面可靠。

技术领域

本发明涉及烟草及烟草制品检测领域，具体涉及一种测定气-液界面暴露下卷烟烟气细胞毒性的方法。

背景技术

卷烟烟气的细胞毒性试验是评价吸烟对健康影响的重要手段之一。细胞毒性试验主要包括两步：受试物的暴露和暴露后细胞存活率的检测。卷烟烟气暴露是测定细胞毒性的第一步，目前卷烟烟气暴露多采用烟气冷凝物和实际接触状态的气-液界面暴露染毒两种方式。细胞进行烟气冷凝物暴露时，溶剂萃取的烟气冷凝物与处于培养液环境的细胞接触，而烟气成分在溶液中和气溶胶中差别较大，溶液的烟气成分不能真实反映人体接触烟气气溶胶的真实状态而且染毒时间长。气-液界面暴露染毒采用新鲜烟气与位于培养液上部的细胞直接接触，可真正模拟人体呼吸系统接触烟气的状态，更加真实全面地反映卷烟烟气的生物学效应。另外，气-液界面暴露过程中，细胞反应比烟气冷凝物暴露更加敏感，能够快速完成暴露过程，缩短整个实验时间。

2002年国际烟草科学研究合作中心推荐采用中性红试验方法测定细胞毒性，但该方法操作步骤繁琐，涉及多次清洗容易引入误差。噻唑蓝法，简称“MTT法”，是一种不同于中性红的试验方法，该检测方法不需要固定细胞和洗涤细胞，完成卷烟烟气暴露和细胞孵育后，细胞可直接进行检测。因此，可以避免多次洗涤步骤造成细胞的流失。

随着日趋严格的烟草监管立法和深层次的吸烟与健康研究，烟草公司努力寻求风险更低的新型烟草制品，作为公司未来替代传统卷烟的产品。加热不燃烧卷烟作为一种新型烟草制品，烟气中有害成分释放量远低于传统卷烟。但针对加热不燃烧卷烟烟气的细胞毒性检测，大都采用了烟气冷凝物的暴露方式，未见气-液界面暴露方法。

目前，未见将气-液界面暴露和噻唑蓝联合起来对卷烟烟气导致的细胞毒性进行检测的报道，另外，未见上述联合方法对加热不燃烧烟草制品的细胞毒性进行检测。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种可以提高检测的灵敏度和准确性，同时简单快捷的测定气-液界面暴露下卷烟烟气细胞毒性的方法，具体技术方案如下：

将气-液界面暴露法和噻唑蓝法(又名MTT法)联合起来对卷烟烟气导致的细胞毒性进行检测。该方法既适用于传统卷烟产品，也适用于新型烟草制品烟气的细胞毒性检测。

在进行所述气-液界面暴露法时，将细胞以0.8～1.2*10⁶个/孔的密度接种于插入式培养板(又称Transwell培养板)；以流速为8～12mL/min的烟气对细胞进行染毒处理。

气-液界面暴露和噻唑蓝的联合检测方法以新鲜烟气为受试对象，能够较好地反映人体呼吸系统接触卷烟烟气的过程；暴露过程中细胞对烟气更为敏感，从而缩短了受试物暴露时间；检测过程中的不需要清洗细胞，避免了细胞的损失，提高了检测的准确性。

不过，虽然采用气-液界面暴露法可以增强细胞对烟气的敏感性，但容易出现细胞因为非烟气原因死亡(表现为空气对照组也有超出正常数量的细胞死亡)或者出现细胞敏感性降低(表现为烟气处理组中的死亡细胞明显少于预期情况)等现象，使得检测的敏感性和准确性难以得到兼顾。对此，本发明研究发现，细胞的接种密度和烟气处理时的流速对上述问题的影响较大，进而经过多次尝试，优化得到了：当细胞的接种密度和烟气处理时的流速同时处于上述限定范围内时，有利于对烟气检测的敏感性和准确性的兼顾。