[发明专利]一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法

权利要求书

1.一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：挑选诱导分化第50-60天的人多能干细胞来源的3d视网膜杯，除去RPE及其他非3d视网膜杯组织，然后置于含有液体培养基的容器中，机械分离，离弃3d视网膜杯中的较暗及棕黑色部分的色素层，保留金黄色部分的神经层，再将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞；

所述的人多能干细胞来源的3d视网膜杯是通过以下方法制备的：将贴壁生长的人多能干细胞消化为小细胞团得到拟胚体，将拟胚体接种到mTeSR1培养基中培养，逐步将mTeSR1培养基替换为神经诱导培养基，当完全替换为神经诱导培养基时将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养，然后吸去神经诱导培养基更换为视网膜分化培养基，直至形成突出于培养板孔底表面的三维视网膜组织，再将三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中，将三维视网膜组织按1个三维视网膜组织/孔接种于含有视网膜分化培养基的低吸附培养板中悬浮培养，悬浮培养1周后吸去视网膜分化培养基更换为RC2培养基，培养得到人多能干细胞来源的3d视网膜杯；

所述的将拟胚体接种到mTeSR1培养基中培养，逐步将mTeSR1培养基替换为神经诱导培养基，当完全替换为神经诱导培养基时将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养具体为：将构建拟胚体当天记为诱导分化第0天，次日记为第1天，以此类推，第0天将拟胚体接种到含有10μM RI的mTeSR1培养基中培养，第1天，将含有10μM RI的mTeSR1培养基替换为培养基A，所述的培养基A是由神经诱导培养基和mTeSR1培养基按体积比1:3混合而成，第2天，将培养基A替换为培养基B，所述的培养基B是由神经诱导培养基和mTeSR1培养基按体积比1:1混合而成，第3天，将拟胚体按1个拟胚体/孔接种到含有神经诱导培养基的经Matrigel包被的培养板中开始贴壁培养；

所述的液体培养基为RC2培养基，所述的RC2培养基是以DMEM/F12 1:1培养基和DMEM基础培养基按体积比为10:7混合作为基础培养基，每425mL基础培养基中加入不含有维生素A的50×B27 10mL、100×antibiotic and antimycotic 5mL、100×MEM-NEAA 5mL、FBS50mL、100×GlutaMax 5mL和1000×Taurine 0.5mL；

所述的神经诱导培养基是以DMEM/F12 1:1培养基作为基础培养基，每500mL基础培养基中加入100×N2 5mL、肝素1mg和100×MEM-NEAA 5mL；

所述的视网膜分化培养基是以DMEM/F12 1:1培养基和DMEM基础培养基按体积比3:2混合作为基础培养基，每500mL基础培养基中加入不含有维生素A的50×B27 10mL、100×antibiotic and antimycotic 5mL和100×MEM-NEAA 5mL。

2.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，其特征在于，所述的将贴壁生长的人多能干细胞消化为小细胞团具体为：人多能干细胞维持培养于mTeSR1培养基中，待克隆生长至占满80％～90％孔底面积时，将已分化的细胞刮除，吸去mTeSR1培养基，用无菌PBS润洗后加入已复温至37℃的0.5mM EDTA，放入37℃ CO₂培养箱中消化5-6min，吸去EDTA，取mTeSR1培养基轻轻吹落细胞，得到小细胞团。

3.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，其特征在于，所述的将三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中具体为：用尖头玻璃针将三维视网膜组织附着于孔底的基底部组织松解，轻轻推动其隆起部分使三维视网膜组织脱离孔底悬浮于视网膜分化培养基中。

4.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，其特征在于，所述的将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞具体为：将神经层转移至培养皿中，吸弃液体培养基后加入PBS，将神经层分割成若干个小组织片，吸弃PBS后加入accutase于37℃水浴中20min消化细胞，吸弃accutase，加入PBS反复吹打细胞，过滤后回收细胞，将回收的细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞。