[发明专利]一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法。包括以下步骤：挑选诱导分化第50‑60天的人多能干细胞来源的3d视网膜杯，除去RPE及其他非3d视网膜杯组织，然后置于含有液体培养基的容器中，机械分离，离弃3d视网膜杯中的较暗及棕黑色部分的色素层，保留金黄色部分的神经层，再将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞。本发明的制备方法可获得数量稳定的3d视网膜组织，可获得数量可控的纯度较高的视网膜前体细胞，可缩短视网膜前体细胞获得的时间并简化了获得的工序，获得的视网膜前体细胞具有较强的增值能力及重新向视网膜其他类型的细胞分化的能力。

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法。

背景技术：

目前视网膜细胞的退行性变、损伤及坏死成为了致盲眼病中重要的病因之一，而干细胞的替代治疗成为治疗这一类视网膜病变的新希望。随着诱导多能干细胞(iPS)的广泛应用，原本限制干细胞与再生医学发展的伦理及免疫排斥问题得到了很好的解决。早在20世纪80年代，科学家们就已经诱导小鼠、蛙等动物的干细胞分化为视网膜的节细胞、光感受器等。在此后的时间里，不断有人视网膜细胞被诱导分化获得，也有许多研究团队尝试将特定的视网膜细胞类型移植进入视网膜。但人类视网膜有着严格的排列分层，各类的细胞也有特定的定位和方向，单细胞的注射移植难以满足这些要求，更无法实现功能的重建。因此，具有完整分层结构的视网膜组织成为了移植与替代治疗的新供体材料。

人多能干细胞(hPSC)包括hESC和hiPSC，可以向机体几乎所有细胞分化，为细胞治疗提供种子细胞，展示了巨大应用前景。各国正投入大量资金开发关键技术，抢占市场先机。眼睛由于其自身解剖、生理特点及多种无创检查手段，被认为是干细胞临床转化研究的优势器官。多项hPSC临床转化的首例都应用在视网膜变性疾病的治疗，首次公开报道的ESC临床试验(Schwarttz et al，Lancet 2012)；第一例自体iPSC及率先批准的异体iPSC的临床研究(日本Masayo Takahashi团队，2013及2016)。这些I期临床研究初步显示了安全性,尽管疗效尚不确定。目前用于临床研究的hPSC来源视网膜细胞都为视网膜色素上皮细胞(RPE)。然而，RPE只是视网膜中的支持细胞，视网膜变性疾病除了RPE损伤，还有视网膜功能神经元细胞变性损害，更需要补充替代。因此，如何获取、制备视网膜细胞，特别是功能神经元细胞，是神经致盲眼病细胞治疗中的关键难题，是急需解决的技术瓶颈。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法。

本发明的人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法，包括以下步骤：挑选诱导分化第50-60天的人多能干细胞来源的3d视网膜杯，除去RPE及其他非3d视网膜杯组织，然后置于含有液体培养基的容器中，机械分离，离弃3d视网膜杯中的较暗及棕黑色部分的色素层，保留金黄色部分的神经层，再将神经层消化成单细胞置于含有RDM培养基的经Matrigel包被的培养板内得到视网膜前体细胞。

所述的液体培养基优选为RC2培养基，所述的RC2培养基是以DMEM/F12(1:1)培养基和DMEM基础培养基按体积比为10:7混合作为基础培养基，每425mL基础培养基中加入不含有维生素A的50×B27 10 mL、100×antibiotic and antimycotic 5mL、100×MEM-NEAA5mL、FBS 50mL、100×GlutaMax 5mL和1000×Taurine 0.5mL(不需添加任何其他神经营养因子)。