[发明专利]目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用

说明书

本发明提供了一种目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用。其中，锚定方法包括通过对目标生物分子进行标记，使目标生物分子带上氨基基团和信号标记；利用氨基基团将目标生物分子锚定到凝胶中。通过采用对目标生物分子进行标记的方式使其带上氨基基团和信号标记，既能使具有氨基基团的目标生物分子带上标记信号，也能使不具有氨基基团的目标生物分子，比如脂质或糖类，进行标记的同时带上氨基基团，进而使得该目标生物分子通过氨基基团采用现有的锚定方法锚定到凝胶中，从而实现了任何类型的生物分子的凝胶锚定，进而便于实现后续的膨胀显微成像。

技术领域

本发明涉及生物体标记领域，具体而言，涉及一种目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用。

背景技术

ExM技术于2015年由Edward S.Boyden组所开发。具体实现过程为，利用丙烯酸钠与共聚剂丙烯酰胺以及交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺穿透到生物样品内部，并在其中进行自由基聚合。经过适度的蛋白酶酶切或者高温变形，从而使得样品力学均一化，带有大量羧酸根基团的聚电解质凝胶在吸水后因电性相斥发生膨胀，使得锚定在凝胶中的生物分子得以各向同性地膨胀(如图1所示)。

在ExM技术中，如何将生物分子锚定到凝胶中至关重要。目前主要有下列方法：(1)合成三功能的DNA链或者化学小分子，分别带有锚定基团、报告基团以及识别基团；(2)利用丙烯酰胺活性酯与生物分子上的氨基残基反应，实现对生物分子上修饰上丙烯酰胺；(3)利用戊二醛通过对生物分子上的氨基进行交联，与聚合物凝胶形成互穿聚合物网络，游离的醛基也可以与在聚合过程中与凝胶中的游离氨基偶联，从而达到生物分子锚定到凝胶中的目的。上述方法可以使得荧光信号在膨胀后得以保留。目前在传统的荧光显微镜如共聚焦或宽场荧光显微镜下，膨胀四倍的ExM技术使得分辨率提升到70-80nm。而且膨胀对样品中荧光分子的相对位置信息扰动较小，可以应用到细胞以及组织中的超分辨成像。

目前ExM技术被逐渐应用于细胞或者组织样品中蛋白质、RNA等生物分子的成像，解决了许多之前只能用昂贵、费时的超分辨显微镜才有可能去研究的生物问题。ExM与其他成像技术的结合同样方兴未艾，如与SIM、STED、STORM等超分辨成像技术等结合，使分辨率得到进一步提升。应用导向型工作也呈现出爆发式增长，诸多课题组证明了ExM可以被应用到各种体系中，如小鼠、涡虫、果蝇、斑马鱼、细菌，甚至被应用到DNA折纸术、蛋白晶体中。

尽管前人开发的ExFISH方法中利用鸟嘌呤烷基化试剂使得RNA连接上丙烯酰基，实现了对RNA的成像，但是难以实现具有DNA、RNA分子特异性的ExM标记、锚定以及成像。因此ExM技术中的另一大挑战是如何实现非蛋白分子的超分辨成像，如对脂质、糖类、核酸分子、小分子药物、代谢物以及化学探针进行ExM标记以及成像。

同时由于目前锚定生物分子到凝胶中的方式主要利用基于氨基的化学连接，但是像糖类、脂质、小分子药物、代谢物以及化学探针等分子本身不具有氨基基团，因此难以被锚定到凝胶中。除此之外，糖类以及脂质等非蛋白质生物分子无法利用遗传编码方式进行标记，同时也缺乏广谱性免疫荧光手段，该类型生物分子在ExM技术中的标记难题也需要解决，因此目前的ExM技术无法对该类型分子进行标记以及成像。

此外在ExM成像过程中，由于样品体积增大数十倍，荧光分子浓度被大幅稀释，自由基聚合过程中也会造成部分荧光染料结构被破坏。这两个因素都会造成ExM成像中荧光信号弱、信噪比低等缺点，因此ExM技术也亟需信号放大的方法。

当前ExM技术主要集中在利用荧光蛋白或者免疫荧光等蛋白质水平的成像，但是如何实现具有时间分辨能力的针对蛋白质在合成以及降解过程中的ExM标记以及成像方法目前也还没有有效的方案。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种目标生物分子的锚定方法、膨胀显微成像方法及其应用，以解决现有技术中尚未有合适的方法能够利用ExM对某些生物分子(比如某些脂质、糖类等)进行荧光标记以及超分辨成像的问题。