[发明专利]PCA3和PSA RNA检测试剂盒和扩增体系

说明书

本发明涉及一种PCA3和PSA基因检测试剂盒和扩增体系，包括有针对PCA3和PSA基因引物和荧光探针和Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶，其中，针对PCA3基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，荧光探针的序列如SEQ ID NO.3所示；针对PSA基因的引物如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，和荧光探针的序列如SEQ ID NO.12所示。本发明在现有试剂盒的基础上，优化了实时荧光定量RT‑PCR的检测扩增体系。PCA3基因选择外显子3上的序列设计检测效果更好的引物和探针，反应体系中引入更适合RNA扩增的优化后的Tris‑MOPS‑柠檬酸钠缓冲液及引进了Stoffel片段或Tfl DNA聚合酶，提高检测灵敏度、特异性的同时，可耐受更多的模版。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种尿液外泌体中PCA3和PSA RNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒和扩增体系。

背景技术

前列腺癌(Prostate Cancer)在欧美发达国家是最常见的男性恶性肿瘤之一，2018年美国癌症协会数据显示：前列腺癌发病率高居美国男性肿瘤发病率第一位，死亡率居第二位。在我国,随着生活水平的不断提高及环境变化,前列腺癌的发病率也逐年升高。我国约60％的前列腺癌患者初诊时就已是晚期转移患者，这将对我国前列腺癌患者的治疗效果及长期生存产生直接影响。自2008年起，前列腺癌已成为泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤，国内前列腺癌发病率城乡差异较大，特别是大城市的发病率更高。2009年北京、上海、广州的前列腺癌发病率分别达到19.30/10万、32.23/10万和17.57/10万。

目前学术界较为公认的前列腺癌早期临床诊断模式为“三阶梯”法：①通过血前列腺特异性抗原(PSA)等肿瘤标志物检查和直肠指检发现可疑病例。由于PSA有限的敏感性和特异性，存在对低风险前列腺癌的过度诊断和对高级别前列腺癌的诊断不足的缺陷。②视具体情况，选择经直肠前列腺超声、多参数磁共振扫描等影像学检查完成可疑病灶的定位诊断。③通过TRUS引导下的前列腺系统活检获得病理诊断。PSA增高而作穿刺活检后有高达五分之四的人癌症为阴性，即使在真阳性者中有高达半数在其余生也不大可能出现问题。前列腺穿刺活检和治疗也有风险：活检有0.6％～4.1％的感染并发症，而根治性前列腺手术导致的性功能问题估计有20％～70％而排尿问题有5％～50％。穿刺活检对病人生理及心理伤害较大，目前国外存在一种尿液PCA3分子检测，用于决定是否需要重复前列腺穿刺活检。长链非编码RNA前列腺癌抗原3(prostatecancer antigen 3，PCA3)基因已被美国FDA批准作为诊断前列腺癌的标志物。

前列腺癌新的标记物PCA3，在前列腺癌中高表达，可反应前列腺癌进展情况。PCA3位于9号染色体，含有4个外显子，为非编码的mRNA，通过选择性剪切和多聚腺苷酸化产生至少四种不同的转录产物。RT-PCR分析显示PCA3仅在前列腺组织中表达，在其他组织中不表达。PCA3在95％的检测的全部前列腺癌中过度表达，可从前列腺癌变细胞中无害测定，且准确度接近100％。此外，在前列腺外组织(良性和恶性)中尚未检测到PCA3转录产物，证明PCA3是目前已知前列腺癌最具特异性的PCa标志物。PCA3不受年龄，前列腺体积或其他前列腺病的影响。Northern blot检测分析50例患者中47例PCA3高度表达，而前列腺良性病变组织中不表达或低度表达。比较端粒酶RNA和PCA3RNA作为前列腺癌的标记物，PCA3指示作用更优。PCA3作为目前为止针对前列腺癌特异性最优的标志物，含有4个外显子，三个内含子，之前的报道中，都认为PCA3外显子4用于前列腺癌检测特异性最优。