[发明专利]一种鉴别糙海参卵巢发育期雌参个体的方法

说明书

本发明公开了一种鉴别糙海参卵巢发育期雌参个体的方法。抽取糙海参的体腔液，然后离心分离出卵黄蛋白，再经SDS‑PAGE电泳和染色，通过电泳结果将卵巢发育期的雌参、雄参以及性腺未发育的糙海参区别开来。卵巢发育期雌参个体样品呈现200‑250kD的特征条带，而性腺未发育个体和雄参个体样品均无出现该特征条带。本发明可以在不损伤糙海参的情况下，通过抽取体腔液样品鉴别卵巢发育期雌参个体，对于人工育苗时亲参的选取具有应用价值。

技术领域

本发明属海水养殖生物技术领域，具体涉及一种鉴别糙海参卵巢发育期雌参个体的方法。

背景技术

糙海参(Holothuriascabra)又名白参、沙参，隶属棘皮动物门、海参纲、枝手亚纲、楯手目、海参科、海参属。分布于西从纳塔耳港到红海、向东到加罗林群岛、斐济群岛、向北到日本、向南到澳大利亚以及中国大陆的广西、广东、海南等地，一般生活于岸礁边缘以及潮流强和海草多的沙底。糙海参体壁较厚，具有丰富的胶原蛋白，口感爽滑富有弹性，不但具有很高的营养价值，而且还具有极高的药用价值。糙海参是一种重要的热带海参养殖品种和出口创汇的高档水产品。它具有生长迅速、养殖方式简单多样、病害少、市场需求量大等特点，在我国华南沿海地区具有极大的养殖开发潜力。

我国华南地区糙海参的繁殖期在每年5-9月，通常通过阴干、流水刺激法对亲参进行人工催产。只有精巢发育的雄参和卵巢发育的雌参可用于人工催产，其中卵巢发育的雌参较难获得。卵巢发育的雌参个体在外观上与性腺未发育的个体及雄参个体均无差别，给糙海参的人工繁育时亲参的选取带来困难。因此，亟需开发一种可以在不损伤海参的条件下将卵巢发育期的雌参鉴别出来的方法。

超速离心沉降法是指利用离心力的作用将分散体系中的分散质点逐渐沉降，从而分离的方法。溶液中的颗粒在受到强大的离心作用时，如果颗粒密度大于溶剂密度，颗粒就会下沉。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别糙海参卵巢发育期雌参个体的方法，利用本发明的方法能够鉴别糙海参卵巢发育期雌参个体，从而可以在不损伤糙海参的情况下，通过抽取体腔液样品鉴别卵巢发育期雌参个体，对于人工育苗时亲参的选取具有应用价值。

本发明发现卵巢发育期的雌参体腔液中富含卵黄蛋白，而性腺未发育的个体及雄参个体均不含有该蛋白。但由于体腔液中还含有与卵黄蛋白分子量接近的杂蛋白，因此，难以通过SDS-PAGE蛋白电泳直接鉴定体腔液中的卵黄蛋白。卵黄蛋白是一种载脂蛋白，与脂类形成脂蛋白复合体。本发明通过超速离心方法，可以首先将脂蛋白(卵黄蛋白)和其他非脂结合的杂蛋白分离开来，从而去除先前在SDS-PAGE蛋白电泳中与卵黄蛋白分子量相近的杂蛋白。然后取脂蛋白进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，通过电泳结果将卵巢发育期的雌参、雄参以及性腺未发育的糙海参区别开来。

因此，本发明的鉴别糙海参卵巢发育期雌参个体的方法，包括以下步骤：

抽取糙海参的体腔液，然后离心分离出卵黄蛋白，再经SDS-PAGE电泳和染色，通过电泳结果将卵巢发育期的雌参、雄参以及性腺未发育的糙海参区别开来。具体是在200-250kDa处有明显条带的为卵巢发育期雌参个体，而性腺未发育个体和雄性个体均不具备该特征条带，由此鉴别出糙海参卵巢发育期雌参个体。

优选，所述的离心分离出卵黄蛋白是通过超速离心分离出卵黄蛋白。糙海参的体腔液经高速离心后，其卵黄蛋白位于上清液的上部，吸取上清液的上部即可获得分离出的卵黄蛋白。具体方案为：将含有浓度为1mM PMSF、密度为1.215g/mL的KBr的溶液4mL加入超速离心管底部，将1mL糙海参的体腔液加入超速离心管上部，在Himac CP 100MX超速离心机，使用P100AT-0132转子，以180,000g转速、10℃离心24h，取上部300μL液体，即为包含卵黄蛋白的溶液。

所述的染色是考马斯亮蓝染色。

优选，所述的抽取糙海参的体腔液是用预先加入蛋白酶抑制剂PMSF溶液的注射器穿过糙海参体壁，插入到达体腔，抽取体腔液。