[发明专利]一种用于调控水稻硝酸还原酶活性的NIA1磷酸化位点及其应用

权利要求书

1.用于调控水稻硝酸还原酶活性的NIA1磷酸化位点，其特征在于，该位点是位于NIA1氨基酸序列532位的丝氨酸残基。

2.根据权利要求1所述的用于调控水稻硝酸还原酶活性的NIA1磷酸化位点，其特征在于，丝氨酸残基位于NIA1氨基酸序列的保守基序上，具体基因序列SEQ ID NO.1:RSTSTPFM。

3.将权利要求1所述的用于调控水稻硝酸还原酶活性的NIA1磷酸化位点应用于定向突变表达载体。

4.根据权利要求3所述的将用于调控水稻硝酸还原酶活性的NIA1磷酸化位点应用于定向突变表达载体，其特征在于，定向突变表达载体是将位于NIA1氨基酸序列532位的丝氨酸突变为天冬氨酸基因序列OsNia1_S532-D和丙氨酸基因序列OsNia1_S532-A后插入双元表达载体pCUbi1390-GFP的Hand III和BamH I酶切位点所得。

5.将权利要求1所述的用于调控水稻硝酸还原酶活性的NIA1磷酸化位点应用于水稻基因OsNia1过表达载体。

6.根据权利要求5所述的将用于调控水稻硝酸还原酶活性的NIA1磷酸化位点应用于水稻基因OsNia1过表达载体，其特征在于，水稻基因OsNia1表达载体是将水稻基因OsNia1插入双元表达载体pCUbi1390-GFP的Hand III和BamH I酶切位点所得。

7.将用于调控水稻硝酸还原酶活性的NIA1磷酸化位点应用在水稻定向突变株系上，其特征在于，具体步骤如下：

1)提取总RNA

选用水稻品种Kitaake作为RNA的提取材料，待水稻幼苗生长至约20d，取叶片液氮冻存；而后取部分液氮冻存叶片，用研钵研碎，按照RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒说明提取水稻叶片总RNA并检测其完整性；

2)克隆水稻基因OsNia1

根据水稻OsNia1的全长序列设计两端引物，以步骤1)获得的水稻叶片总RNA转录合成的cDNA第一链为模版，采用高保真KOD FX酶进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，将目的基因与pCUbi1390-GFP过表达载体进行连接获得表达载体pCUbi1390-GFP-OsNia1，测序获得水稻基因OsNia1的cDNA序列；

3)水稻基因OsNia1表达载体构建

根据步骤2)获得水稻基因OsNia1的cDNA序列，利用primer 5.0软件分别以OsNia1基因的cDNA起始密码子ATG为F引物起始碱基和基因末端去掉终止密码子开始碱基，即以GAA为R引物的起始碱基设计OsNia1基因扩增引物，最后加上pCUBi1390-GFP载体接头，即为扩增水稻基因OsNia1基因全长引物P1:SEQ ID NO.2和P2:SEQ ID NO.3；

以步骤2)中获得的表达载体pCUbi1390-GFP-OsNia1模版，经PCR扩增后，将OsNia1的cDNA克隆至载体双元表达载体pCUBi1390-GFP中，测序鉴定确保双元表达载体pCUBi1390-GFP中编码区阅读框架正确，得水稻基因OsNia1过表达载体；

4)水稻硝酸还原酶NIA1磷酸化位点S532的预测和鉴定

利用NetPhos 3.1Server在线软件预测水稻NIA1蛋白上可发生磷酸化作用的氨基酸残基，推测水稻硝酸还原酶NIA1磷酸化位点；最后利用NR抗体与磷酸化抗体对该位点的磷酸化情况进行检测，得出水稻硝酸还原酶NIA1磷酸化位点是位于NIA1氨基酸序列532位的丝氨酸残基；

5)定向突变目的基因的克隆

在OsNia1基因序列中找到磷酸化位点S532的基因序列，根据天冬氨酸和丙氨酸的氨基酸序列进行定向突变，在突变位点前后各加上15个碱基，作为突变天冬氨酸和丙氨酸的正向引物P3:SEQ ID NO.4和P4:SEQ ID NO.5，其反向互补序列为反向突变引物P5:SEQ IDNO.6和P6:SEQ ID NO.7；

以OsNia1基因测序正确的质粒pCUbi1390-GFP-OsNia1为模版，分别以全长引物P1和反向突变引物、正向突变引物及全长引物P2进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得突变位点的前段和后段，而后以突变位点的前段和后段等量混合物为模版，以全长引物P1、P2进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得已定向突变的目的基因；

6)水稻NIA1磷酸化位点定向突变载体构建

将步骤5)的获得的定向突变目的基因克隆至载体双元表达载体pCUBi1390-GFP中，测序鉴定确保双元表达载体pCUBi1390-GFP中编码区阅读框架正确，得水稻NIA1磷酸化位点定向突变载体；

7)转基因植株的获得

将步骤3)获得的水稻基因OsNia1过表达载体和步骤6)获得的水稻NIA1磷酸化位点定向突变载体分别转入农杆菌，进一步转入粳稻品种Kitaake中，转基因植株经PCR和RT-PCR验证获得纯合OsNia1过表达株系和NIA1磷酸化位点定向突变的过表达株系以进行对比检验。