[发明专利]基于高通量测序的蕨麻根际微生物多样性及菌群解析方法

说明书

本发明公开了一种基于高通量测序的蕨麻根际微生物多样性及菌群解析方法，包括以下步骤：S1.采集高原蕨麻在根区外土壤及根际土壤；S2.从各样品土壤中提取微生物总DNA，PCR扩增上述总DNA中16SrDNA；S3.对扩增产物质量鉴定，并将不同样品PCR扩增产物按等质量进行混合；S4.对混合文库进行片段大小和定量检测，并高通量测序；S5.准确测定各样品土壤微生物群落组成，进行生物信息学分析。本发明解析方法能解析高原蕨麻根际微生物群落的多样性特征。

技术领域

本发明属于土壤微生物学技术领域，具体涉及一种基于高通量测序的蕨麻根际微生物多样性及菌群解析方法。

背景技术

蕨麻含丰富淀粉，市称“蕨麻”或“人参果”，治贫血和营养不良等，又可供甜制食品及酿酒用；根含鞣料，可提制栲胶，并可入药，作收敛剂；茎叶可提取黄色染料；又是蜜源植物和饲料植物。蕨麻为青藏高原特有资源植物，因富含维生素、氨基酸及各种矿质元素，历来被藏区群众用于食品、保健品和藏药使用，藏医称“卓老酒曾”。

土壤微生物是土壤中的必不可少的部分，土壤的质量和稳定性和土壤微生物的群落结构多样性有很大的关系，因此对土壤微生物的研究就很有必要性。

土壤微生物的遗传多样性是指土壤生态系统中的微生物在基因水平上所携带的遗传物质和遗传信息的总和；与高等生物相比，微生物的遗传多样性更加突出，不同微生物种群间的遗传物质和遗传信息具有非常显著的差异。土壤微生物遗传多样性的分析方法主要包括两类：第一类是基于杂交的分析方法，第二类是基于PCR的分析方法。杂交分析方法是基于核酸分子的碱基互补配对原理，利用特异性的探针与待测样品的核酸分子进行杂交的过程；杂交技术是通过测定DNA重组率或DNA杂交动力相似度来研究土壤微生物的遗传多样性，用于研究微生物遗传多样性的杂交探针主要包括rRNA基因探针、抗性基因探针和编码代谢酶基因探针等，其中应用比较普遍的杂交技术包括荧光原位杂交(Fluorescence inSitu Hybridization，FISH)技术，肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)杂交技术以及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术等，各有优点，但均是低通量的分析方法。

研究表明，以前的传统方法测得的微生物数量少，大约为微生物总数的0.1～10％。这些传统方法只能在门、纲等等级高的层次上检测出微生物的种类，这样就无法从整体上描述土壤中土壤微生物的群落结构，也就不能得出不同植被下土壤中含有微生物的差异。随着科学技术的不断发展，相继出现了分子生物学等技术，在发展过程中出现了高通量测序技术，随即在科研中发展起来。

高通量测序技术是对传统测序技术的一次巨大的改革，一次可以对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此也称其为下一代测序技术(next generationsequencing)，足见其划时代的意义，除此之外，高通量测序技术又被称为深度测序(deepsequencing)，因此通过高通量测序法来鉴定土壤微生物的群落结构及种类。

根际(Rhizosphere)被定义为紧密围绕着有生命力植物根系的生物活性区域，其中包含大量微生物，包括细菌、真菌和放线菌，也包括一些藻类和病毒等，范围一般为距离根表面1cm以内。不同植物甚至同一植物的不同生育期，其根系分泌物会对根际微生物的生长繁殖产生影响；而根际微生物又参与土壤中有机物质的分解、腐殖质的形成、养分的转化和循环等多种生理生化过程，尤其是其中的固氮菌群，通过生物固氮作用在常温下把氮气转化为能被植物利用于合成各种氨基酸的氨。土壤根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异等不仅受到植物根系影响，也受土壤类型、农业耕作管理、季节变化、重金属污染、杀虫剂处理等影响。另外不同的检测技术对根际微生物群落指标的准确性也有影响。因此，准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微环境影响的重要基础，也是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础。

发明内容