[发明专利]全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建

权利要求书

1.一种DNA甲基化转化试剂盒，其特征在于，包括TET酶反应液，所述TET酶反应液包括如下独立包装的组分：TET酶氧化缓冲液；所述TET酶氧化缓冲液包括如下微摩尔份的组分：HEPES或Tris–Cl(20-167)×10³份，NaCl(100-333)×10³份，α-KG或2-oxoglutarate 3.3×10³份，抗坏血酸6.67×10³份，和三磷酸腺苷4×10³份；所述TET酶氧化缓冲液pH＝8.0。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TET酶反应液还包括独立包装的Fe(NH₄)₂(SO₄)₂溶液，所述Fe(NH₄)₂(SO₄)₂溶液中Fe(NH₄)₂(SO₄)₂的浓度为0.75-1.5mM；优选的，所述TET酶反应液还包括独立包装的TET酶液，所述TET酶的浓度为8-10.5μM。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包括独立包装的吡啶硼烷还原剂；优选的，所述吡啶硼烷还原剂包括独立包装的如下组分：吡啶硼烷溶液，吡啶硼烷浓度为10M；和醋酸钠溶液，醋酸钠浓度为3M，pH＝4.3。

4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在全基因组甲基化测序、DNA甲基化测序或靶向区域DNA甲基化测序中的用途。

5.一种全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐的测序文库构建方法，其特征在于，包括使用权利要求1-3任一项所述的试剂盒进行“C”到“T”的转化。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在TET酶反应液氧化步骤中，将待“C”到“T”转化的文库与所述TET酶反应液混合配制TET酶氧化反应体系，以50μL为计：

DNA文库，30～100ng；

Fe(NH₄)₂(SO₄)₂，终浓度95-105μM；

1×TET酶氧化缓冲液，10-20μL；

Tet酶，终浓度0.048-0.06μM；

无酶水补足至50μL。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在TET酶反应液氧化步骤中，反应条件为：于37℃，反应1-3h，随后加入蛋白酶K，于37-50℃孵育0.5h-1h；优选的，将使用TET酶反应液氧化后的产物进行吡啶硼烷还原步骤中，将所述产物与吡啶硼烷还原剂混合，于37℃，850rpm下孵育16h-32h。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，经“C”到“T”转化后的文库进行PCR扩增，所使用的PCR扩增酶包括KAPA HIFI Urail+聚合酶、NEB Q5 Urail酶、Pfu TurboCx Hotstart聚合酶或Taq酶；优选的，经“C”到“T”转化后的文库进行PCR扩增的反应程序为：98℃起始变性45sec；98℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，8个循环；72℃延伸1min；4℃，∞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将扩增后的文库进行二代测序，测序平台包括但不限于Illumina平台、MGI或者Gene+Seq平台；优选的，所述测序平台为Gene+Seq平台。

10.一种如权利要求4-9任一项所述的方法构建的全基因组甲基化测序文库。