[发明专利]全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建

说明书

本发明涉及生物信息学技术领域，具体涉及一种全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐的测序文库及构建、用途，包括TET酶反应液，所述TET酶反应液包括如下独立包装的组分：TET酶氧化缓冲液；所述TET酶氧化缓冲液包括如下微摩尔份的组分：HEPES或Tris–Cl(20‑167)×10³份，NaCl(100‑333)×10³份，α‑KG或2‑oxoglutarate 3.3×10³份，抗坏血酸6.67×10³份，和三磷酸腺苷4×10³份；采用上述试剂盒结合Fe(NH₄)₂(SO₄)₂以及TET酶可以将5mc氧化为5cac，5cac在还原剂作用下被还原为二氢尿嘧啶，经PCR测序识别为T，实现在非重亚硫酸氢盐条件下的DNA甲基化“C”到“T”转化，解决现有的基于亚硫酸氢盐转化构建的甲基化测序文库存在的碱基不平衡，测序数据使用率低的缺陷，该配方还具有组分精简，TET酶使用量极低，显著降低成本的效果。

技术领域

本发明涉及生物信息学技术领域，具体涉及一种全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐的测序文库及构建。

背景技术

DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式。近年来，大量研究表明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生，起着至关重要的作用。

甲基化测序的一个金标准是全基因组重亚硫酸盐测序(Whole genome bisulfitesequencing，WGBS),简称BS-seq。其检测原理是用重亚硫酸氢盐处理，将基因组中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后进行的PCR扩增过程中，采用U碱基耐受的聚合酶，将U碱基识别为胸腺嘧啶(T)，实现C->T的转化，与原本具有甲基化修饰的C碱基分开来，从而达到将未修饰C碱基和甲基化修饰C碱基分开的目的。WGBS可以将～95％未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，可覆盖70～99％的胞嘧啶，实现单碱基分辨率的甲基化测序。

根据重亚硫酸氢盐转化(BS)在传统建库中加入的步骤，可分为BS前建库和BS后建库法。由于目前的PCR过程，不能完整保留甲基胞嘧啶(mC)的信息，转化前的文库不能进行扩增，因此，第一种先建库后BS方法，是对接头连接的dsDNA进行BS转化，如中国专利文献CN104532360B中公开的全基因组甲基化测序文库及其构建方法。在上述的先建库后BS方法中，BS转化过程中会造成大量的模板降解(0.1～99.9％)，接头连接-dsDNA起始量越低，模板降解地越多，并且BS前建库策略需要采用甲基化的接头连接dsDNA，以避免接头在BS转化过程中发生转化，造成建库失败。故而，第一种先建库后BS的方法要求起始量>200ng，且构建的文库中AT占比>80％，碱基不平衡；

第二种BS后建库方法，先进行重亚硫酸氢盐转化会产生大量的片段化的单链DNA，需要将单链DNA合成为dsDNA，常见的有两种：直接单链连接和随机引物扩增。多数采用的策略是随机引物扩增单链DNA。随机引物扩增法，则需要4N,6N,8N,9N长度的随机引物，以单链为模板，合成双链DNA。随机引物法的测序reads，在3’末端的结合具有一定的偏好性，表现在3’-末端的SNPs较多，比对率较低(～50％)，因此会损失大量的测序数据。一些研究者发现，采用特殊的单链连接酶，加一段tail和测序接头直接连接，对单链模板的利用率更高，更适合低起始量物质的建库。单链连接策略可实现对低起始量物质的甲基化检测，然而建立的文库依然存在AT占比>80％，碱基不平衡的缺陷，而且它将Illumina的P5和P7截断序列连接在单链上，很难实现其他平台的测序兼容性。

由上述可见，基于亚硫酸氢盐转化的建库方法构建的文库AT占比>80％，碱基不平衡缺陷，上机检测需要混和其他全基因组文库进行测序，操作不便，同时构建的文库测序数据使用率较低，有效数据仅占测序量的20～30％。

发明内容