[发明专利]一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用。所述的胶原蛋白材料是基于组织工程技术制备的具有良好生物相容性、机械性能、降解性能的支架材料。本发明涉及胶原蛋白支架的制备、胶原蛋白黑素细胞复合物的构建。黑素细胞在支架材料上有较高的细胞活性，较优的黑色素分泌能力。胶原蛋白黑素细胞复合物避免了细胞移植过程中细胞悬液的流失，为细胞提供了一个良好的三维生长环境。本发明制备的胶原蛋白黑素细胞复合物可用于白癜风患者或色素缺失及表皮层损伤患者。

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用。

背景技术

白癜风是一种常见的原发性、局限性或泛发性的色素脱失性的皮肤黏膜疾病。皮损初发时为一片或几片色素减退斑，逐渐发展成为境界清楚的乳白色斑片，白斑境界清楚，白斑内毛发正常或变白。全身各部位均可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。该病任何年龄段均可发生，且无明显性别差异，通常分为局限型、散在型和泛发型。损坏患者皮肤，影响美观，进而影响患者的正常生活、工作和社交，降低生活质量，是皮肤科损容性难治疾病之一。

白癜风的传统治疗手段包括内服药物，紫外线照射及外科手术等，而紫外线照射治愈很有限，药物治疗毒副作用大，均不适合长期使用。目前外科手术治疗方法主要包括自体表皮移植，但是局限在于表皮移植需要正常部位取皮，造成新的创面，护理难度较大。目前临床上使用的细胞移植中悬液易流失，且不适合大面积移植，此外，在尖端部位也较难固定。因此，利用组织工程技术构建黑素细胞-支架复合材料可以有效改善以上治疗的不足之处。此类复合材料为细胞起到固定支撑作用，避免了细胞悬液的流失，同时支架材料可以招募更多的修复细胞，修复细胞分泌内源性修复因子，参与组织重建与创面修复。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胶原蛋白黑素细胞复合物、制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。

根据本发明的第一个方面，本发明采用以下技术方案：

一种胶原蛋白黑素细胞复合物的制备方法，其特征在于，它先制备交联的胶原蛋白海绵支架材料，在交联的胶原蛋白海绵支架材料上接种黑素细胞，然后进行体外培养而获得。

制备交联的胶原蛋白海绵支架材料的方法进一步包括以下步骤：将合适大小的胶原蛋白加入反应溶剂中，加入交联剂，磁力搅拌；反应结束后，清洗，冷冻干燥，灭菌。

优选地，所述胶原蛋白是水产动物胶原蛋白，如鱼鳞胶原蛋白、鱼皮胶原蛋白等，或是哺乳动物胶原蛋白，如牛跟腱胶原蛋白、猪皮胶原蛋白等；胶原蛋白厚度为0.5-10mm的海绵，剪成不大于培养皿的形状，比如边长为0.5-3cm的长方形或正方形；反应溶剂为乙醇或水相，优选90％乙醇或pH＝5.5的PBS溶液；交联剂采用EDC和NHS，交联剂EDC：NHS的摩尔比为1:1-1:4之间；磁力搅拌时间为2-72h，优选24-48h；反应温度为4-30℃，优选反应温度为20-25℃；清洗条件为磷酸盐缓冲液浸泡1-2h，纯化水清洗1-24h。冷冻干燥温度可以是-60～-80℃

在交联的胶原蛋白海绵支架材料上接种黑素细胞、进行体外培养包括以下步骤：预铺胶原蛋白海绵支架材料到细胞培养板中，取100μl-1000μl黑素细胞按2*10⁴-2*10⁷个/ml的密度接种在胶原蛋白海绵支架材料上，置于细胞培养箱37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养；接种黑素细胞的胶原蛋白支架培养30min-2h后，补充细胞培养基1ml-10ml，继续置于细胞培养箱37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养；铺有胶原蛋白海绵支架材料的培养板每两天换一次细胞培养基，培养时间为1-25天，即可获得黑素细胞-胶原蛋白复合物。

黑素细胞为人的黑素细胞；所述人的黑素细胞为自体或异体组织提取的黑素细胞。所述自体或异体组织可以为皮肤、毛囊等。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了上述技术方案制备的胶原蛋白黑素细胞复合物。