[发明专利]一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用

权利要求书

1.一种非诊断目的的PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法包括以下步骤：

（1）用pH 9.6的碳酸盐将能够有效识别PCV2b和PCV2d的Cap蛋白氨基酸序列，反应呈强阳性的单抗1A6按1:8000稀释，按每孔100 μL加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300μl PBST洗涤5次，拍干剩余液体；

所述的单抗1A6 来源的阳性单克隆细胞系被命名为小鼠杂交瘤单克隆细胞1A6株；该细胞1A6株已于2019年11月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No. 18844；

（2）分别加入100 μLBSA封闭3 h，弃去板中液体，用300μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；

（3）PCV2d VLPs按100 ng/孔加入后，于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300μLPBST洗涤5次，拍干剩余液体；

（4）将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；

（5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300μLPBST洗涤5次，拍干剩余液体；

（6）加入50μL TMB室温显色5 min；

（7）加入50μL 2 M的H₂SO₄终止反应，OD₄₅₀读数。

2.如权利要求1所述的非诊断目的的PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于所述的PCV2d VLPs是利用Cap表达体系表达PCV2 Cap，利用镍柱亲和层析技术获得纯化后的PCV2 Cap，经SDS-PAGE电泳鉴定后，将PCV2 Cap在体外组装成PCV2 VLPs。

3.如权利要求1所述的非诊断目的的PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于其中的兔多抗是将纯化后得到的 PCV2d VLPs与弗氏佐剂按1:1混合，免疫家兔获得的血清，并对血清中的IgG进行纯化而成。

4.如权利要求1所述的非诊断目的的PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法用于PCV2d VLPs的特异性定量以及定性，检测最低浓度能够达到62.5 ng/mL，灵敏度高，相关系数R²为0.992，定量准确性好。

5.如权利要求1所述的非诊断目的的PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法适用于PCV2d 的VLPs定量和组装效率鉴定。