[发明专利]一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用

说明书

本发明涉及一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用。利用猪圆环病毒2型PCV2d VLPs免疫小鼠，筛选杂交瘤细胞，制备的抗体可以特异性识别PCV2(PCV2b、PCV2d均可识别)，可用于WB、IFA等PCV2相关检测；利用该抗体包被ELISA检测时发现不与Cap蛋白发生反应，能够用于区分VLPs和Cap。基于该单克隆抗体经过一系列反应条件的优化建立了夹心ELISA，可用于PCV2 VLPs的特异性定量以及定性，检测最低浓度可达到62.5ng/ml，灵敏度高，相关系数R²为0.992，定量准确性好，适用于PCV2b与PCV2d VLPs的定量，可应用于PCV2不同基因型VLPs的定量、组装效率鉴定以及PCV2病毒侵染鉴定。

技术领域

本发明涉及一种PCVd病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用，属于动物疾病诊断和生物制品领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是猪皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征和繁殖障碍综合征的主要病原体，对养猪行业具有重要的经济效益影响。PCV2基因组约1.7Kb，属于单股正链环状DNA病毒，包含两个主要的开放阅读框，ORF2编码病毒核衣壳蛋白(Cap)，ORF1编码与病毒复制有关的Rep蛋白。病毒核衣壳(Capsid)是由60个Cap蛋白亚基组成的正二十面体，无囊膜，其粒子直径约17nm，

目前采用疫苗作为预防方式进行防控，当前市场疫苗主要包括勃林格殷翰、武汉中博以及扬州优邦等利用杆状病毒系统生产的PCV2病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)亚单位疫苗，南农高科技股份有限公司生产的PCV2 SH株灭活疫苗，普莱柯利用大肠杆菌表达系统生产的PCV2 VLPs亚单位疫苗。其中PCV2 VLPs亚单位疫苗是由PCV2 Cap蛋白组装而形成，不含病毒核酸，不具有感染性，而且能够产生很好的保护效果。

目前PCV2 VLPs的鉴定方式包括透射电子显微镜、分子筛色谱法、细胞间接免疫荧光法等。透射电子显微镜仪器价格昂贵，操作程序过多，需要专业的技术人员才能够进行熟练操作拍到清晰的图像资料，只能观察VLPs的轮廓。但是不能用于VLPs的准确定量。PCV2VLPs是由60个Cap亚基组装形成的正二十面体，其分子量大，在分子筛中对应的紫外吸收峰很早就出现，因此可以通过读取仪器提供的紫外吸收峰图来判定样本中是否含有PCV2VLPs。在PCV2 VLPs的鉴定中也可以利用间接免疫荧光对PCV2 VLPs进行鉴定。当PCV2 Cap未形成VLPs的时候，无法进入细胞内部，在PCV2 Cap组装形成VLPs后，VLPs即可进入细胞内部，随后进行间接免疫荧光等相关操作，如果发现细胞呈现阳性信号，即可判断样本中含有PCV2VLPs，该方法能够鉴定判定VLPs的存在，但不适合定量分析。