[发明专利]一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用，包括以下步骤：(1)传统法制备单分散SiO₂微球；(2)丁二酸改性；(3)浸渍SiO₂微球；(4)多孔PVDF膜的制备；(5)多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料的制备。将制备的多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料应用于C肽定量限考察，通过与未分散免疫磁珠对比，用多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料提取C肽纯品后将定量限由柱上0.3ng降低至0.05ng，与日本计量院发表的C肽潜在参考测量程序相比，不通过衍生化处理后就能达到定量正常人血清C肽的目标，简化了检测流程，同时减少了磁珠和抗体的用量。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，特别是涉及一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用。

背景技术

临床上，测定C肽的浓度能得知胰岛细胞的功能，对糖尿病的诊断和治疗具有重要的意义。C肽商业化的免疫测定方法是通过C肽免疫反应活性来测定C肽浓度，但是通常会出现检测值偏高的情况。同位素稀释质谱法时能够区别内源和外源蛋白质，从而能直接准确的测定目标物质。日本计量院将6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)修饰C肽N端氨基，氨基喹啉基可以通过在肽段中添加正电荷来提高电离效率，化学修饰和磁珠免疫提取法提高了血清中C肽的定量限，其柱上0.003～2.9ng范围内线性关系良好，相对标准偏差为4.0％，加入NMIJ CRM 6901-b作为标准物质，提供了一种潜在的C肽标准测量程序，但是该方法流程复杂，会影响结果准确度。

目前在同位素稀释质谱法的样品前处理中，蛋白质类样品通常是通过抗原和抗体免疫结合进行分离，其特异性和高效性为提取低丰度复杂基质中样品提供了便捷途径。因此将具有超顺磁性物质的表面包覆不同的官能团与抗体或抗原进行共价或非共价结合，既可以发挥抗原抗体的特性结合优势，又可以发挥超顺磁性物质的特点，通过磁场的改变达到混合均匀、高效分离和基质残留量少的目的。目前的研究都集中在建立颗粒表面功能化和探索固定抗体最优方法方面，以达到特异性富集和获得最佳提取效率的目的。由于磁性粒子可以用不同的合成方法来制备，它们的大小和理化性质有很大的差异，这限制了对抗体可靠结合能力的预测。因此，定量控制颗粒的可变性和功能化，开发通用的分析方法来准确定量结合抗体的数量是非常重要的。

Dynabeads免疫磁珠是一种均匀无孔、超顺磁性、单分散和高度交联的聚苯乙烯微球，由均匀分散的γ-Fe₂O₃和磁铁矿(Fe₃O₄)的混合物组成。磁珠因有超强的顺磁性，具有能够在磁场中迅速聚集固定和离开磁场后又能迅速均匀分散的特点。同时，微纳米级别的磁珠比表面积高，沉降速率极低，在包覆丰富的官能团之后，能够应用到各种物质的提取和富集中。与传统的分离方法相比，Dynabeads免疫磁珠孵育时间短、可以使生化样品复杂组分的分离和富集同时进行，实验结果背景干扰少、重现性好。

免疫磁珠的无孔结构在一定程度上能降低杂质的捕获能力，减少抗体的消耗，但是在提取血清基质中蛋白质，尤其是低丰度蛋白时，提取后的剩余基质中依然可以检测到大量剩余目标蛋白的存在，说明磁珠在提取过程中富集效率有限，远远没有达到理想状态。另外磁珠粒径的不均一化可能会阻碍部分免疫磁珠定位到磁铁而造成实验中目标蛋白的丢失。同时在前处理过程中，低丰度样品的浓度越低往往需要的磁珠量越多，因此磁珠和抗体的添加量都是远远过量的，造成了极大的浪费。

因此本发明从增加抗体和抗原的接触面积，确定抗原和磁珠的接触方向为出发点制备多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠的复合材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法，具体为：