[发明专利]一种基于多腺嘌呤和多信号系统的电化学传感检测体系及其应用

说明书

本发明提供了一种基于多腺嘌呤和多信号系统的电化学传感检测体系及其应用，所述检测体系包括金电极，所述金电极表面修饰有捕获探针；所述捕获探针包括靶标dsRNA的5’端互补序列和多腺嘌呤尾。本发明通过向检测体系中加入DMSO，打开dsRNA的二级结构、弱化碱基对间的氢键，提高对大片段dsRNA的检测灵敏度；采用含有靶标dsRNA的5’端互补序列和多腺嘌呤尾的捕获探针修饰金电极，基于多腺嘌呤尾与金电极的强亲和力，得到可以特异性识别捕获靶标dsRNA的电化学表面；采用多信号探针系统的方式向体系中引入更多的信号标记，放大了检测信号，实现了对RNAi转基因dsRNA的特异性灵敏性检测。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种基于多腺嘌呤和多信号系统的电化学传感检测体系及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)首先在真核生物中发现，主要利用与靶基因具有同源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)调控基因的表达。目前，RNAi技术已经在农业生物领域得到广泛的应用，用于控制昆虫、细菌、真菌、病毒和寄生植物等多种目标生物的侵害。在虫害控制领域，相比于传统的化学方法，RNAi转基因方法具有经济有效、特异性强、稳定性好、环境友好等优势。然而，RNAi技术的潜在风险也值得关注，例如，RNAi可能会造成非靶标基因的沉默，还可能对人类和环境存在危险性。目前，国际上尚无一种标准指导RNAi转基因生物的风险评估，因此有必要建立一种新的方法用于特异性检测RNAi转基因生物或环境中的dsRNA，进一步确定RNAi转基因生物的风险性。

截至目前，还没有针对转基因生物dsRNA的检测方法，而针对生物样本中dsRNA的检测方法主要包括RT-PCR或基于定量技术(QuantiGene technology)的核酸杂交。其中，RT-PCR具有通量较高、灵敏性强的优势，但是由于dsRNA具有反向重复结构，使得RT-PCR的特异性较弱；此外，RT-PCR需要特殊昂贵的实验设备，只能在实验室环境中使用，具有一定的局限性。基于定量技术的核酸杂交检测方法灵敏度高，不需要进行核酸提取便可用于检测组织裂解物中的dsRNA，但是，该方法耗时较长，且同样需要特殊的实验设备。

电化学核酸生物传感器(E-biosensor)具有成本低、耗时短、灵敏度高、便携性等优势，已广泛应用于DNA检测领域。采用E-biosensor进行RNAi转基因生物的dsRNA检测，存在以下待解决的问题：dsRNA的长度较长，可达1000nt，而传统的E-biosensor主要用于检测短链DNA；dsRNA存在复杂的二级结构，不容易与探针进行杂交。

因此，有必要构建一种新的快速、简便的dsRNA检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基于多腺嘌呤和多信号系统的电化学传感检测体系及其应用，所述检测体系利用多腺嘌呤捕获探针识别dsRNA，并利用多信号系统进行信号放大，增强了检测体系对dsRNA的特异性和灵敏度。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种dsRNA电化学传感检测体系，所述检测体系包括金电极，所述金电极表面修饰有捕获探针；

所述捕获探针包括靶标dsRNA的5’端互补序列和多腺嘌呤尾。

本发明中，采用含有靶标dsRNA的5’端互补序列和多腺嘌呤尾的捕获探针修饰金电极，基于多腺嘌呤尾与金电极的强亲和力，得到可以特异性识别捕获靶标dsRNA的电化学表面，有利于提高dsRNA的检测灵敏度。

优选地，所述捕获探针的多腺嘌呤尾包括20～40个碱基A。

优选地，所述dsRNA的长度大于500nt，优选为大于1000nt。