[发明专利]一种抗肿瘤的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗及其制备方法

说明书

本发明专利公开了棕榈酸修饰的IKVAV的应用及其抗肿瘤纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗及其制备方法，通过将棕榈酸修饰的IKVAV与表位肽耦联，采用纳米乳和MPLA双佐剂系统，成功制备具有抗肿瘤作用的纳米乳佐剂鼻腔粘膜疫苗。制得的疫苗具有良好的质量稳定性，对BEAS细胞无明显的细胞毒性，同时可促进黏膜上皮细胞对表位肽的摄取，引起Th1型免疫应答，并诱导CTL反应有效杀伤和清除表达OVA258‑276肽段的细胞。该疫苗对EG7.0荷瘤小鼠有效抑制肿瘤的生长并延长小鼠的存活时间，发挥良好预防性和治疗肿瘤效果。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及肿瘤的鼻腔粘膜疫苗，还涉及纳米乳鼻腔粘膜疫苗的制备方法和应用。

背景技术

众多的病原微生物是通过黏膜途径感染人体的，主要是通过人体的一些腔道诸如呼吸道、消化道以及生殖道。腔道直接与外界环境相接触包括空气、食物、水等等，就给病原微生物感染提供了便利。据估计，感染性疾病每年导致630万5岁以下的儿童死亡，排名前三的疾病分别是肺炎、痢疾以及疟疾，分别占总死亡人数的14.9％、9.2％和7.3％，通过呼吸道、消化道传播的感染性疾病导致儿童死亡的比重很大。大部分的传统疫苗通过注射途径免疫不能够诱导很强的黏膜免疫应答，而通过黏膜递送疫苗可以有效诱导抗原特异性的黏膜免疫应答。因此在人体的第一道防线即黏膜部位成功诱导保护性免疫意义十分重大。与此同时，黏膜疫苗也可以和传统注射接种疫苗一样诱导系统性免疫的产生。黏膜疫苗接种途径多样，包含口服接种、鼻内接种、口腔接种等。其中鼻内接种具有诸多优势：由于鼻粘膜具有丰富的毛细血管和淋巴管，其表面积相对较大，有利于疫苗抗原成分的摄取；操作简单，可自行接种；能克服口服接种后抗原易被消化道降解的不足。除了能在黏膜局部诱导产生保护性免疫，黏膜疫苗还有其他一些优势，例如不需要注射，没有痛苦，依从性好，接种率高。也可避免注射器重复使用带来的风险。

虽然鼻内疫苗有诸多的优势，但其开发目前面临许多困难。目前采用黏膜途径递送的人用疫苗屈指可数，例如脊髓灰质炎减毒活疫苗、霍乱疫苗、伤寒热疫苗以及某些流感滴鼻疫苗等。由于人体的鼻黏膜表面具有多重天然的防御机制，例如鼻黏膜表面存在粘液层，给疫苗成功递送带来很大困难，因此鼻内疫苗往往需要合适的递送系统来增加抗原的递送效率，减少抗原在鼻黏膜部位的降解与清除，从而增强疫苗的免疫保护效果。目前主要的递送系统策略包括病毒样颗粒、多聚物纳米粒、脂质体以及纳米乳等，而其中的纳米乳是疫苗优良的递送系统。

纳米乳是一种热动学稳定的油水分散体系，可包裹疫苗抗原成分直接递送于黏膜表面。根据制备工艺和材料的不同，纳米乳的尺寸可介于20-200nm间，与病原体的尺寸接近，可迅速被黏膜摄取并进一步递送至APCs。一般油包水型乳剂适宜递送亲水性药物而水包油型反之，合适的剂型选择可以增强疫苗的缓释效果。因此，纳米乳剂型可以很好地运用于鼻内疫苗，Makidon等的研究发现，重组HBsAg可被包裹至纳米乳中，以之进行鼻内接种免疫可以增强疫苗的免疫保护应答。纳米乳促进抗原黏膜递送涉及多种机制，包括形成胶束、渗透黏膜上皮以及促进淋巴转运等。以MF59为代表的乳剂作为人用疫苗佐剂已使用多年，其安全性及有效性得到了广泛的认可，然而作为黏膜递送系统而言其还存在一些不足，例如其平均粒径在160nm左右，黏膜递送效率不佳，并且只能诱导体液免疫应答而对于细胞免疫应答作用有限。我们前期的研究发现，20-50nm左右的纳米乳作为蛋白抗原的递送系统进行鼻内接种免疫可以显著增强抗原的黏膜免疫应答，增强对宿主的免疫保护效果，针对不同的抗原，能一定程度地增强Th1及Th17应答。上述研究结果提示，纳米乳作为黏膜疫苗递送系统需要进行有针对性的合理设计。

激发获得性免疫是疫苗发挥保护作用的关键，其发挥功能的过程主要是：疫苗抗原穿过黏膜或皮肤等生理屏障，被巨噬细胞等APCs吞噬、分解、加工成不同类型的表位肽，然后被T细胞经T细胞受体(TCR)所识别，同时T细胞表位首先要与MHC分子结合后才能被TCR所识别。CD4+T细胞被其表位肽激活后主要分化为3种辅助性T细胞(Th)：Th1细胞，诱导特异性细胞免疫应答，分泌多种细胞因子；Th2细胞，诱导特异性体液免疫应答；Th17，诱导炎症反应。CD8+T细胞被其表位肽激活后分化为细胞毒性T细胞(CTL)，可直接杀伤病毒、细菌或肿瘤细胞等。