[发明专利]一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶定点整合真核特异表达载体及其构建方法，该多功能融合酶可以表达木聚糖酶，植酸酶，双葡聚糖酶和双纤维素酶活性，将其用于后期制备相应的转基因动物，该动物将自身分泌这些酶，起到消化饲料中木聚糖、植酸、葡聚糖，纤维素等抗营养因子，达到提高饲料利用率，减少污染排放的功效。同时，解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题；解决2A连接肽多基因共表达效率低，基因位置确定困难问题，及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题，达到增强多基因高效共表达效率的目的。此外，还可以解决单个来源的纤维素酶基因表达和水解纤维素效果差的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多功能融合酶XAET和多功能融合酶腮腺组织特异表达的定点整合载体及其构建方法。

背景技术

非淀粉多糖(NSP)是由若干单糖通过糖苷键连接成的多聚体，包括除α-葡聚糖以外的大部分多糖分子。NSP最初是根据提取和分离多糖所采用的方法进行分类的。细胞壁经一系列碱提取后剩余的不溶物叫纤维素，溶在碱液中的物质称为半纤维素。考虑到非淀粉多糖的化学结构及生物功能，人们发现依据其溶解度分类有失精准。通常非淀粉多糖一般分为3大类，即纤维素、非纤维多糖(半纤维素性聚合体)和果胶聚糖。其中非纤维多糖又包括木聚糖、β-葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。按照水溶性的不同，非淀粉多糖又可分为可溶性非淀粉多糖(SNSP)和不可溶性非淀粉多糖(INSP)，这是因为在谷物细胞壁中，一些非淀粉多糖以氢键松散地与纤维素、木质素、蛋白质结合，故溶于水，称为可溶性非淀粉多糖。

非淀粉多糖(NSP)是饲料膳食纤维的主要组成成分，这些纤维将饲料营养物质包围在细胞壁里面，部分纤维可溶解于水并产生粘性物质。这些粘性物质抑制动物的正常消化功能，妨碍动物吸收营养。如将这些NSP去除，营养物质就能从细胞壁里释放出来，从而提高代谢能和蛋白质的利用率。玉米、小麦中均含有大量的NSP，许多植物蛋白源，如大豆粕，同样含有 NSP。在饲料中添加酶制剂，可将这些NSP去除，如大豆粕中被细胞结构包围的淀粉和蛋白就可释放，从而提高了大豆粕的代谢能和蛋白质的利用率。

在饲料中添加酶制剂可以解决NSP的消化吸收问题，但酶制剂在饲料制粒和膨化过程中容易受高温失活，还增加了饲料的成本，也对饲料的储存条件更加严苛，增加了运输和饲用成本。因此，亟需一种其他的解决办法。近几年，陆续有研究表明，将可以表达木聚糖酶、葡聚糖酶等纤维素素或非纤维素多糖的酶基因转入动物体内，通过获得表达该基因的转基因动物，可以通过该动物自身分泌和表达相应的酶，来消化饲料中的NSP，达到提高饲料营养消化吸收的目的。因而，利用转基因育种技术培育在猪体内表达自身缺乏的消化酶的动物新品种是解决饲料抗营养问题的新途径。2001年加拿大科学家Golovan等(2001)首次利用将大肠杆菌耐酸性植酸酶appA基因整合到猪体内，提高饲料磷的消化率，粪磷排放量显著降低75％。2013年本课题同样利用猪腮腺分泌蛋白上游调控区域成功制备得到转纤维素酶基因小鼠(Huang et al.,2013)和转甘露聚糖酶基因小鼠(李紫聪等，2013)，2018年zhang等用2A多肽将木聚糖酶-葡聚糖酶-植酸酶融合后导入猪基因猪，提高猪生产性能，减少磷氮排放。在公开号为 CN106086068A专利中亦公开了利用2A连接肽，实现了果胶酶-木聚糖酶- 植酸酶-纤维素酶融合表达，但表达效率不高。然而这些现有技术，存在如下问题，转单基因，表达量高，但表达酶种类少，消除个别饲料营养因子对动物性能改善水平有限，经济价值不大。2A介导的转多基因依然存在共表达效率不高，多基因融合酶的首尾基因表达不一致的问题，基因位置难以确定，还存在一些基因序列会干扰2A的剪切，导致表达产物功能尚失。

发明内容