[发明专利]胶质瘤细胞中高效特异表达的自杀基因腺病毒及构建方法在审
| 申请号： | 201911171025.7 | 申请日： | 2019-11-26 |
| 公开（公告）号： | CN110964747A | 公开（公告）日： | 2020-04-07 |
| 发明（设计）人： | 王浩;项威;胡继良;潘建青;王俊 | 申请（专利权）人： | 深圳市人民医院 |
| 主分类号： | C12N15/861 | 分类号： | C12N15/861;C12N15/65;C12N15/54;A61P35/00 |
| 代理公司： | 广州京诺知识产权代理有限公司 44407 | 代理人： | 肖金艳 |
| 地址： | 518000 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 胶质 细胞 高效 特异 表达 自杀 基因 病毒 构建 方法 | ||
1.一种胶质瘤细胞中高效特异表达的自杀基因腺病毒，其特征在于，该腺病毒基因组中包含有c-fos启动子、自杀基因和在正常细胞高表达并在胶质瘤细胞中表达确实的miR-128的互补序列，所述自杀基因位于所述c-fos启动子的下游，所述miR-128的互补序列位于所述自杀基因的下游。
2.如权利要求1所述的胶质瘤细胞中高效特异表达的自杀基因腺病毒，其特征在于，所述腺病毒通过下述方法构建：
使用PCR方法克隆c-fos基因启动子片段，将其连接到腺病毒表达载体上，在c-fos启动子下游连接自杀基因及miR-128的互补序列，构建出腺病毒重组表达载体；将腺病毒重组表达载体转染293细胞，待细胞有出毒迹象时，收集病毒上清，并将病毒扩增至P3代，其后用腺病毒纯化试剂盒纯化病毒，以获得所述腺病毒。
3.如权利要求2所述的胶质瘤细胞中高效特异表达的自杀基因腺病毒，其特征在于，所述自杀基因为单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-TK，所述腺病毒表达载体为pDC315。
4.如权利要求3所述的胶质瘤细胞中高效特异表达的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒纯化试剂盒选用ViraBind腺病毒纯化试剂盒。
5.如权利要求2所述的胶质瘤细胞中高效特异表达的自杀基因腺病毒，其特征在于，所述miR-128的互补序列通过以下方法确定：
使用PCR方法克隆不同片段长度的c-fos启动子片段，设计CMV增强子(IE)序列，优化启动子与多克隆位点(MCS)及表达框(ORF)的距离，设计出高效转录表达的表达框；
将表达框连接到pGL4表达载体上，克隆出pGL4-cfos重组表达载体；
通过miRBase数据库，设计若干条序列不同的miR-128的互补序列，并将其分别串联到pGL4-cfos重组表达载体的3’末端，构建出若干种序列不同的pGL4-cfos-miR128重组表达载体；
利用外源荧光素酶法检测各pGL4-cfos-miR128重组表达载体中的c-fos启动子在胶质瘤细胞和正常细胞中的转录水平，筛选出在胶质瘤细胞中具有较高转录水平而在正常细胞中具有较低转录水平的pGL4-cfos-miR128重组表达载体，将该pGL4-cfos-miR128重组表达载体所对应的miR-128的互补序列作为构建腺病毒重组表达载体所需的miR-128的互补序列。
6.一种腺病毒的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：
使用PCR方法克隆c-fos基因启动子片段，将其连接到腺病毒表达载体Pdc315上；
在c-fos启动子下游连接自杀基因及miR-128的互补序列，构建出腺病毒重组表达载体；
将腺病毒重组表达载体转染293细胞，待细胞有出毒迹象时，收集病毒上清，并将病毒扩增至P3代，其后用腺病毒纯化试剂盒纯化病毒，以获得所述腺病毒。
7.如权利要求6所述的腺病毒的构建方法，其特征在于，在c-fos启动子下游连接自杀基因及miR-128的互补序列，构建出腺病毒重组表达载体时，其还可将用于标记的绿色荧光蛋白基因GFP连接在c-fos启动子下游。
8.如权利要求6所述的腺病毒的构建方法，其特征在于，所述miR-128的互补序列通过以下方法确定：
使用PCR方法克隆不同片段长度的c-fos启动子片段，设计CMV增强子(IE)序列，优化启动子与多克隆位点(MCS)及表达框(ORF)的距离，设计出高效转录表达的表达框；
将表达框连接到pGL4表达载体上，克隆出pGL4-cfos重组表达载体；
通过miRBase数据库，设计若干条序列不同的miR-128的互补序列，并将其分别串联到pGL4-cfos重组表达载体的3’末端，构建出若干种序列不同的pGL4-cfos-miR128重组表达载体；
利用外源荧光素酶法检测各pGL4-cfos-miR128重组表达载体中的c-fos启动子在胶质瘤细胞和正常细胞中的转录水平，筛选出在胶质瘤细胞中具有较高转录水平而在正常细胞中具有较低转录水平的pGL4-cfos-miR128重组表达载体，将该pGL4-cfos-miR128重组表达载体所对应的miR-128的互补序列作为构建腺病毒重组表达载体所需的miR-128的互补序列。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于深圳市人民医院，未经深圳市人民医院许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201911171025.7/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
