[发明专利]胶质瘤细胞中高效特异表达的自杀基因腺病毒及构建方法

说明书

一种胶质瘤细胞中高效特异表达的自杀基因腺病毒及构建方法，其特征在于，腺病毒通过下述方法构建，使用PCR方法克隆c‑fos基因启动子片段，将其连接到腺病毒表达载体上，在c‑fos启动子下游连接自杀基因及miR‑128互补序列，构建出腺病毒重组表达载体；将腺病毒重组表达载体转染293细胞，待细胞有出毒迹象时，收集病毒上清，利用病毒上清将病毒扩增至P3代，其后用腺病毒纯化试剂盒纯化病毒。本发明通过将miR‑128互补序列放在自杀基因的下游，正常细胞高表达miR‑128，而miR‑128互补序列可沉默miR‑128表达的目的，从而可对自杀基因在正常细胞中的表达发挥抑制效果，而胶质瘤细胞中miR‑128表达缺失，自杀基因可以在胶质瘤细胞中大量转录，从而能够进一步提高自杀基因在胶质瘤细胞中的靶向性，实现了自杀基因在胶质瘤细胞中高效且特性性的表达。

【技术领域】

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种胶质瘤细胞中高效特异表达的自杀基因腺病毒及构建方法。

【背景技术】

神经系统的肿瘤中，胶质瘤的恶性程度是最高的，发病人群主要集中在30-40岁之间的成人及10-20岁之间的青少年。目前，临床对胶质瘤的标准治疗包括手术切除、放疗及化疗。在成人中，患者手术后联合放化、疗的中位生存期只有14.6个月；一部分儿童患者，3年生存率低于20％。脑胶质瘤预后差，严重危害人民生命安全。其浸润性生长特点，与正常脑组织无明显界限，并向周围正常脑组织呈指状浸润破坏，导致传统的治疗方法如手术切除、放疗、化疗等均很难将其根除。近年来，基因治疗被广泛应用于多种肿瘤的治疗研究，为脑胶质瘤的治疗带来曙光。

目前，自杀基因治疗策略已被广泛应用于肿瘤基因治疗研究，具有潜在的重大临床应用价值。单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)基因是肿瘤基因治疗应用最广泛的自杀基因。单纯疱疹病毒胸苷激酶能将一些对哺乳动物细胞无毒性的核苷类似物转化成有毒性的磷酸化物，阻止细胞DNA的正常合成。当HSV-TK基因被导入肿瘤细胞后，联合应用更昔洛韦(ganciclovir,GCV)不仅能杀灭转染的肿瘤细胞，并且能通过旁观者效应杀伤周围没有转染的肿瘤细胞。迄今为止，采用HSV-TK基因转染联合GCV的“自杀基因”疗法已在卵巢癌、恶性黑色素瘤等人类实体细胞肿瘤治疗实验中取得了较好的效果。

自杀基因在肿瘤细胞中高效、特异性的表达对基因治疗的有效性和安全性有着极其重要的影响，也是目前基因治疗所面临的巨大挑战之一。开发和利用肿瘤特异性启动子为解决这一问题提供了一种可行的途径。近年来，已知的可作为肿瘤研究的特异性启动子主要有端粒酶(Tert)启动子、甲胎蛋白(AFP)启动子、癌胚抗原(CEA)启动子以及前列腺特异性抗原启动子等。

虽然目前基于这些肿瘤或组织特异性启动子的靶向基因治疗已经取得了一定的疗效，但由于肿瘤特异性启动子在正常细胞中仍然有少量的表达，限制了基因治疗的给药剂量，为了保障安全，不得不延长给药间隔时间，从而明显降低了基因治疗的疗效。另外，启动子也可能会因体内信号传导的复杂性而逐渐失去活性。因此，为了实现基因治疗早日进入临床试验，需继续寻求更安全、更有效的策略以及高效、靶向性的方法表达自杀基因，从而高效发挥抗胶质瘤的作用。