[发明专利]一种25-羟基维生素D3

权利要求书

1.一种制备25-羟基维生素D₃抗原的方法，其特征在于，该方法包括如步骤：

a)以25-羟基维生素D₃为原料，将羟基进行保护；

b)将羟基保护后的25-羟基维生素D₃经Wacker氧化A环末端双键成醛；

c)将步骤b)得到的醛氧化成羧酸或还原成醇引出含羧基的偶联臂；

d)将步骤c)得到的产物脱去羟基保护后形成含羧基的半抗原；

e)将半抗原与大分子蛋白偶联，经纯化后，得到25-羟基维生素D₃抗原；

步骤a)具体为：

25-羟基维生素D₃的硅醚保护

取200mg25-羟基维生素D₃Ⅰ溶于5mL DMF，加入150mg咪唑，降至0℃，加入250mg三异丙基氯硅烷(TIPSCl)，20-30℃反应15h；

停止反应，加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，室温搅拌10min，用200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，并有机层通过无水硫酸钠干燥，减压浓缩得431mg粗品Ⅱ；

步骤b)具体为：

25-羟基维生素D₃A环末端双键经过wacker氧化反应成醛

取18mg PdCl₂和98mg CuCl加入到250mL三口瓶中，加入7mL DMF和1mL水，室温搅拌下，通入氧气至反应液面下，反应0.5h，将431mg粗品Ⅱ溶于7mL DMF和1mL水，10分钟内将其加入到三口瓶中的反应液中，室温搅拌并持续通入氧气反应15h；

停止反应，加入50mL水，用200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得452mg粗品，过硅胶柱得213mg化合物Ⅲ；

步骤c)、d)和e)中，根据偶连臂的4种选择，步骤c)、d)和e)的4种具体步骤如下：

25-羟基维生素D₃抗原ⅠA的合成：

取100mg化合物Ⅲ溶于4mL四氢呋喃和4mL水，降至0℃，加入100mg次氯酸钠，室温反应18h，加入5mL饱和氯化铵溶液搅拌10min，加入200mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×50mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得92mg化合物Ⅳ；

取30mg化合物Ⅳ，溶于12mL四氢呋喃，加入20mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得22mg粗品，爬板得9mg化合物Ⅴ；

取9mg化合物Ⅴ，溶于0.5mLDMF，加入3mgNHS和5mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为12mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h；

将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D₃抗原ⅠA；

25-羟基维生素D₃抗原ⅠB的合成：

取62mg化合物Ⅳ溶于4mLDMF，加入10mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)和16mgDCC，室温下反应10h，再加入7mg 3-氨基丙酸，室温下反应12h，加入10mL水搅拌10min，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得65mg化合物Ⅵ；

取65mg化合物Ⅵ，溶于20mL四氢呋喃，加入42mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入20mL饱和碳酸氢钠溶液，加入150mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×30mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得31mg粗品，爬板得16mg化合物Ⅶ；

取16mg化合物Ⅶ，溶于0.5mLDMF，加入4mgNHS和7mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到4mL浓度为13mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h，将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D₃抗原ⅠB；

25-羟基维生素D₃抗原ⅠC的合成：

取112mg化合物Ⅲ溶于5mL四氢呋喃，降至5℃，加入21mg硼氢化钠，室温反应12h，降至5℃，加入10mL饱和氯化铵搅拌10min，加入100mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得125mg粗品，爬板得89mg化合物Ⅷ；

取59mg化合物Ⅷ溶于5mLDMF，降至10℃，加入16mg3-溴丙酸乙酯和12mg碳酸钾，室温反应12h，过滤，滤液加入10mL水和100mL乙酸乙酯，萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得68mg化合物Ⅸ；

取68mg化合物Ⅸ溶于3mL乙醇，加入3mL浓度为7mg/mL的氢氧化钠水溶液，室温反应15h，用1N盐酸将pH调至5-6，减压浓缩干溶剂，用2×10mL乙醇提取浓缩物，将提取物爬板得13mg化合物Ⅹ；

取13mg化合物Ⅹ，溶于0.5mLDMF，加入4mgNHS和6mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到4mL浓度为11mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h；

将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D₃抗原ⅠC；

25-羟基维生素D₃抗原ⅠD的合成：

取30mg化合物Ⅷ溶于5mL吡啶，加入50mg丁二酸酐，回流反应15h，减压浓缩干溶剂，加入10mL水和100mL乙酸乙酯，萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得75mg粗品，爬板得32mg化合物Ⅺ；

取32mg化合物Ⅻ，溶于10mL四氢呋喃，加入22mg四丁基氟化铵，室温下反应15h，减压蒸干溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，加入150mL乙酸乙酯萃取，有机层依次用2×20mL水洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得21mg粗品，爬板得8mg化合物Ⅻ；

取8mg化合物Ⅻ，溶于0.5mLDMF，加入3mgNHS和5mgDCC，室温下反应15h，将反应液离心取清液，加入到3mL浓度为10mg/mL的BSA的PBS溶液中，4-20℃反应时间15h，将反应液透析，离心取清液得25-羟基维生素D₃抗原ⅠD。