[发明专利]一种25-羟基维生素D3

说明书

本发明提供了一种25‑羟基维生素D₃，本发明还提供了25‑羟基维生素D₃的制备方法，步骤如下：a)以25‑羟基维生素D₃为原料，将羟基进行保护；b)将羟基保护后的25‑羟基维生素D₃经Wacker氧化A环末端双键成醛；c)将步骤b)得到的醛氧化成羧酸或还原成醇引出含羧基的偶联臂；d)将步骤c)得到的产物脱去羟基保护后形成含羧基的半抗原；e)将半抗原与大分子蛋白偶联，经纯化后，得到25‑羟基维生素D₃抗原。本发明的有益效果是：整个制备工艺条件温和，没有苛刻的低温反应条件，氧化双键时也没有使用有毒的臭氧；另外通过氧化A环双键从19位引出偶联臂，制备的抗原最大程度保留了25‑羟基维生素D₃的两个活性基团羟基，所得抗原有较强的特异性和较高的灵敏度。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种25-羟基维生素D₃抗原的制备方法。

背景技术

25-羟基维生素D₃是人体内存储维生素D的主要形式之一，是人体内代谢活动不可缺少的营养物质。体内维生素D的缺乏，使儿童易患佝偻病，老人易导致骨质疏松症。

此外，近年来大量研究表明，维生素D的缺乏直接影响到人体内肿瘤的发生，特别是结肠癌、乳腺癌和前列腺癌；维生素D是一种类固醇激素，有两个主要类型：维生素D₂(麦角钙化醇)和维生素D₃(胆钙化甾醇)。无论哪种形式的维生素D，在血液中均与结合蛋白结合后运输至肝脏，在肝脏中被转换成为25(OH)VD，而后在肾脏中被转化为1,25-(OH)₂VD，这是维生素D发挥作用的生物活性成分。

但人体内循环中的1,25-(OH)₂VD含量极少，半衰期仅有4h。而循环中的 25(OH)VD含量是1,25-(OH)₂VD的1000倍，是维生素D在循环中的主要存在形式，半衰期3周，能够反映人体维生素D的真实水平，是反映个体维生素D状态的最佳指标。

25-羟基维生素D₃的定量检测主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验方法有液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)，由于存在其仪器昂贵、样品前处理复杂，且繁琐费时限制了其应用。免疫学方法有放射免疫测定、竞争蛋白结合测定、免疫层析技术和酶联免疫测定技术，由于具有灵敏、快速、特异和简便等优点，已成为一种必然的趋势。

目前合成25-羟基维生素D₃抗原的方法主要从25-羟基维生素D₃分子结构中的3位或25位点引出偶联臂，无法最大程度保留25-羟基维生素D₃的两个活性基团羟基。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种25-羟基维生素D₃，保留了羟基维生素D₃的两个活性基团羟基，该抗原能产生强免疫应答性，灵敏度高，其结构式为：

在该结构式中，X-L-Y偶连臂有4种选择，分别是：

IA：X为C＝O，L-Y为大分子蛋白质BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；

IB：X为C＝O，L为NH(CH₂)_nC＝O或p-NHPhC＝O，n为1-3，Y为大分子蛋白质 BSA、KLH、OVA或BGG中的一种；

IC：X为CH₂O，L为(CH2)_nC＝O，n为2-4，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、 OVA或BGG中的一种；

ID：X为CH₂O，L为C＝O(CH2)_nC＝O，n为2-3，Y为大分子蛋白质BSA、KLH、 OVA或BGG中的一种。