[发明专利]一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用

权利要求书

1.一种酒酒球菌（Oenococcus oeni）工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）提取植物乳酸杆菌基因组DNA，经PCR扩增，获得脂肪酶基因lipase；

所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述的植物乳酸杆菌为植物乳酸杆菌HX1，菌种保藏编号为CCTCC No.M 2017522；

（2）以质粒pMG36e为模板，经PCR扩增，获得带脂肪酶基因的同源臂基因；

所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

（3）分别将步骤（1）制得的脂肪酶基因lipase和步骤（2）制得的带脂肪酶基因的同源臂基因经线性化后，连接，转化至大肠杆菌，筛选，获得质粒pMG36e-lipase；

（4）以pET30a-nisI质粒为模板，经PCR扩增，获得nisI片段；

所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

（5）以步骤（3）制得的质粒pMG36e-lipase为模板，进行PCR扩增，制得不含有红霉素序列的线性片段；

所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

（6）将步骤（4）制得的nisI片段与步骤（5）制得的不含有红霉素序列的线性片段经连接后，转化乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）MG1363感受态细胞，筛选，制得表达载体pMG36n-lipase；

（7）将步骤（6）制得的表达载体pMG36n-lipase转化酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞，然后在含有Nisin的平板上进行筛选培养，制得酒酒球菌（Oenococcus oeni）工程菌；

所述酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞，采用如下步骤制备：

将酒酒球菌Oenococcus oeni使用添加质量百分比2.5～3.5%甘氨酸的mFT80培养基活化，培养至对数期OD₆₀₀=0.35，离心收集细胞，然后用含0.5mmoL/L 蔗糖、10%（体积百分比）甘油溶液室温下冲洗3～5次，制得酒酒球菌Oenococcus oeni感受态细胞。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增体系如下，总体系50μl:

10×PCR Buffer 10μL

dNTP 4μL

Pfu Taq 0.7μL

上游引物 1μL

下游引物 1μL

模板 1μL

ddH₂O 32.3μL

PCR扩增程序如下：

98℃预变性 3min，98℃变性 30s， 55℃退火 30s， 68℃延伸1 min，35 个循环； 68℃终延伸10min。