[发明专利]一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用，构建方法步骤如下：(1)制备脂肪酶基因lipase；(2)制备带脂肪酶基因的同源臂基因；(3)制备质粒pMG36e‑lipase；(4)制备nisI片段；(5)制备不含有红霉素序列的线性片段；(6)制备表达载体pMG36n‑lipase；(7)将表达载体pMG36n‑lipase转化酒酒球菌感受态细胞，制得酒酒球菌工程菌。本发明获得的具有降解酯类功能的酒酒球菌工程菌可应用于葡萄酒的制造中，避免目前葡萄酒酿造过程中，由于酯类过多造成对葡萄酒的口感香气等产生的不利影响，以减少酒的保藏时间，缩短葡萄酒达到相同口味的生产周期。

技术领域

本发明涉及一种酒酒球菌工程菌的构建方法与应用，属于微生物工程技术领域。

背景技术

酒酒球菌(Oenococcus oeni)是乳酸菌的一种，是一种在葡萄酒生产过程中除了酵母菌外，非常重要的菌种。其作用主要是在葡萄酒的后熟，也就是在葡萄酒酿造后期，利用酒酒球菌特殊的作用，将发酵中产生的大量苹果酸，降解成乳酸和CO₂，从而提升葡萄酒的口感，并降低其酸度，这一特有的发酵过程称为苹果酸-乳酸发酵(MalolacticFermentation MLF)。因此，酒酒球菌和酵母菌是各国葡萄酒生产中被允许添加的仅有的菌种。

中国专利文献CN104845811A(申请号201510237503.5)公开了一种利用酒酒球菌降解氨基甲酸乙酯的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、落缸搭锅、加曲加水、发酵和后处理，在发酵后第5～20天，向发酵液中接种酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066。本发明通过添加能产生EC降解酶的酒酒球菌CICC6066，来降解在酿酒过程中所产生的EC。酒酒球菌(Oenococcus oeni)CICC6066属于乳酸菌，它的添加不会引入基因改造菌株，也无需后续处理，能有效克服目前降解氨基甲酸乙酯的两种途径存在的弊端。

葡萄酿酒中，酯的存在对其口味及品质影响极大。其中如果在发酵过程中产生过多的酯类，比如乙酸乙酯，丁酸乙酯，己酸乙酯等会对酒的口感造成不良影响，从而降低葡萄酒的品质。可是由于酿酒葡萄品质、酿酒工艺等因素，在酿造过程中产生酯类是无法完全避免的，对于这种酯类的处理，最好的办法是使用酯酶(Easterase)将其降解。而目前的适于葡萄酿酒的商用酵母和酒酒球菌，其本身的酯酶活性都很弱。因此，如果采用适当的方法和手段，对酵母或者酒酒球菌进行改造，提高其酯酶活性，就能很好的解决上述问题。考虑到随着发酵的进行，发酵液中的乙醇含量逐渐增加，当酒精浓度达到10％时，大量酵母就要死亡，不能在葡萄酒中长期存在；而酒酒球菌对乙醇则均有更高的耐受性，当酒精浓度到达16％时依然能够存活，可以在葡萄酒中长期存活。基于上述特点，酒酒球菌更加适合酯酶的改造对象。

但由于酒酒球菌直接施用于食品中，而目前对于食品用食用菌的基因改造限制严格，特别是不能采用抗生素抗性基因进行标记，而现有常规的食用菌来源的标记又无法适用于酒酒球菌，导致目前并没有针对酒酒球菌进行基因改造的相关报道，此外，酒酒球菌感受态细胞转化率低，也是制约其改造的主要原因。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种酒酒球菌(Oenococcus oeni)工程菌的构建方法与应用。

本申请以酒酒球菌为研究对象，采取分子生物学方法，从一株具有高脂酶活性的植物乳杆菌中，克隆其酯酶基因lipase，并将其与乳酸菌表达载体pMG36e连接，构建成型的pMG36e-lipase质粒。然后再使用同源重组方法，将质粒中的红霉素抗性片段敲除，置换成符合食品安全的乳酸菌素抗性片段，构建成食品级(GRAS级：Generally Recognized AsSafe)乳酸菌载体pMG36n-lipase，然后转化至宿主酒酒球菌中成功表达。经葡萄酒发酵实验验证，添加经改造的酒酒球菌后，大大降低了发酵液中酯类的含量。

本发明技术方案如下：