[发明专利]采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法

权利要求书

1.采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述中间体为孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇，所述制备方法包括以下步骤：

(1)3位保护：利用甲缩醛作为保护剂，将麦角固醇的3位羟基进行保护，得到麦角固醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；

(2)生长细胞转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683诱变菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，对步骤(1)得到的所述麦角固醇醚化物进行发酵转化；所述B-NRRL 3683诱变菌种的制备方法为：以分枝杆菌B-NRRL 3683为出发菌种，经过斜面培养和二级种子培养，收集菌体制备菌悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行麦角固醇发酵，并检测孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇产量，得到能产生该中间体的目标诱变菌种；

(3)提取：转化结束后对步骤(2)所得的发酵产物进行提取，得到固体产物；

(4)水解：将步骤(3)所得的固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌后抽滤，合并滤液，减压浓缩后加入盐酸进行水解；

(5)精制：将步骤(4)所得的水解产物进行精制提纯。

2.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲缩醛与麦角固醇的质量比为3-20:1。

3.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种的制备方法具体为：

a.以分枝杆菌B-NRRL 3683为出发菌种，在加入2％质量比琼脂的M1固体培养基中斜面培养，将斜面种子接种于M1液体种子培养基中活化，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；取活化好的一级种子按体积比10％接入新的M1液体种子培养基中进行二级种子培养，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；

b.将生长好的二级种子10000rpm离心5min，收集菌体，用pH＝6.0的磷酸钾缓冲液离心洗涤两次，再用pH＝6.0的无菌磷酸钾缓冲溶液制成菌悬液，并将浓度稀释至10⁸-10⁹个/ml；

c.取上述菌悬液2ml，0.1mol/L亚硝基胍溶液1ml，0.2mol/L pH＝6.0的磷酸钾缓冲液2ml，加入离心管中充分混匀，置于30℃水浴避光振荡处理25-35min，离心收集菌体，用PBS冲洗3次，向离心管中加入5ml无菌生理盐水，摇匀后取出一定的菌悬液，用生理盐水稀释，取100ul上述稀释菌悬液涂布于固体平板培养基上，30℃避光培养，挑选生长良好的突变菌株单菌落进行麦角固醇发酵，并检测孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇产量，得到能产生该中间体的目标诱变菌种。

4.根据权利要求1或3所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，琼脂2％，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；

(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；

(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h。